外泌体是一种由多囊泡体与细胞膜融合后向胞外分泌的、直径为 30～150 nm[1]之间的小囊泡，内含蛋白质、脂质、mRNA、miRNA、DNA片段等分子[2-3]。应激条件下，细胞会发生内吞作用，细胞膜内陷并且出芽形成囊泡，即早期胞内体。早期胞内体逐步发育成为晚期胞内体，在发育的过程中，胞内体的胞膜重新发生凹陷出芽，同时将细胞质基质中相应的蛋白质与核酸选择性地包裹于其中，形成许多内囊泡，这一系列囊泡的胞内体统一构成多囊泡胞内体。多囊泡胞内体与质膜发生融合，里面的内囊泡被排出细胞外，形成了外泌体。通常情况下，外泌体通过3种形式与靶细胞作用: ①相邻的细胞将外泌体捕捉；②被距离较远的细胞摄入；③进入循环系统被其他组织吸收[4]。很多细胞在正常或者病理情况下均可以分泌外泌体，外周血、唾液、尿液、细胞上清液、胸腔积液等体液中均可检测到[5]。外泌体在降低心肌损伤、促进心血管再生、促进神经再生、调节免疫应答等方面有重要作用，其可作为肿瘤诊断的早期检查标志物[6]。此外，外泌体的内源性和其高效的膜融合特性使其可作为药物载体，应用于疾病的治疗。过去关于外泌体靶向药物的研究主要集中在将天然生成的外泌体作为药物载体，但近几年越来越多的研究发现，对外泌体进行特定的修饰，能够显著增强其药物载体的靶向性，从而提高用外泌体治疗的有效性[7-8]。分离和提取外泌体并对其鉴定，对于后续的功能研究具有重要意义。负染色后透射电镜观察是最常的鉴定方法，负染色所用的样品形态为悬浮液，悬浮液中的外泌体必须达到一定的浓度和纯度，这样才能与染液产生特异的、背景清晰的结合反应。目前外泌体提取方法有差速离心法、免疫亲和法、隔离筛选法、聚合物沉淀法等，本实验采取的是使用较多的差速离心法，这样提取的外泌体浓度和纯度符合负染色的要求，可观察到外泌体的圆盘状或杯托状结构。用作负染色的染液应具有以下特征：有较强的电子散射能力，这样才能产生足够的图像反差；在电子束的轰击下不会熔解升华；溶解度大，否则析出沉淀会污染染色背景；分子小；与样品之间无化学反应等。负染色的染液一般由重金属盐配制，目前最常用的负染液是磷钨酸、磷钨酸钾和磷钨酸钠；此外，醋酸双氧铀、四氧化锇、钼酸铵等也常用作负染色液。本实验将四氧化锇、磷钨酸、钼酸铵和醋酸双氧铀4种不同染液对外泌体的染色效果进行对比，以期选出对外泌体最合适的染液。
1 材 料 与 方 法
1.1 试剂与仪器 四氧化锇购于美国Polysciences公司，用超纯水配制成1%溶液，避光密封保存，3%磷钨酸和3%钼酸铵染液购于北京索莱宝科技有限公司，醋酸双氧铀购于美国SPI公司，用超纯水配制成1%溶液，避光密封保存。上述溶液均4 ℃保存。碳膜铜网购自北京新兴百瑞技术有限公司，超高速离心机购自Beckman公司，透射电子显微镜购自日立公司。
1.2 外泌体提取 采用差速离心法提取外泌体。促凝管收集正常小鼠血清样本6 mL，然后400 g离心10 min，去除细胞，将上清再3 000 g离心30 min，去除细胞碎片等。将上清用PBS稀释，20 000 g离心30 min，去除大的囊泡。将上清用0.22 μm滤器过滤后100 000 g离心90 min。弃上清，管底的外泌体沉淀用10 mL PBS重悬后100 000 g离心90 min。倒掉上清，外泌体沉淀用200 μL PBS重悬，4 ℃保存。
1.3 负染色及透射电镜观察 采用漂浮法分别用四氧化锇、磷钨酸、钼酸铵、醋酸双氧铀4种不同染液进行负染色，在染色前将4种染液从4 ℃拿出，恢复室温后再进行如下操作：①取外泌体悬浮液20 μL，滴于碳膜铜网上，室温静置1 min，用滤纸从铜网边缘吸去多余样品；②反复多次实验发现，铜网在染色液滴珠上漂浮3次效果最佳，故吸取3滴染液滴在封口膜上，每滴50 μL，将铜网在每滴染液滴珠上漂浮，随后用滤纸吸去多余染液，铜网在第3滴染液上漂浮留置1 min，然后用滤纸吸去残留液；③室温干燥铜网，透射电镜观察。
2 结 果
2.1 四氧化锇负染 在透射电镜下可观察到外泌体表面被染液包被，脂质双层膜不清晰，外泌体典型的杯托状或圆盘状结构不能显示出来，膜周围有透明泡状物质包围，染色背景中有大小不均一的透明泡状物质(图1)。
2.2 磷钨酸负染 在透射电镜下可观察到外泌体表面有部分凹陷，圆盘状结构大致可见，膜的边缘不清晰且呈毛刺状，染色背景中有不明物质，形状不规则，其中圆形不明物质不能与外泌体进行明显区分(图2)。
2.3 钼酸铵负染 在透射电镜下可观察到外泌体的囊泡结构，表面凹陷，可见不规则的杯托状结构，膜边缘较清楚，染色背景较清晰，但是反差较弱(图3)。
2.4 醋酸双氧铀负染 在透射电镜下可观察到外泌体表面凹陷，呈现典型的杯托状及圆盘状的囊泡结构，胞膜结构清晰可见，膜边界清楚锐利，染色背景干净，反差明显，观察效果最佳(图4)。
图1 四氧化锇负染色外泌体(Bar=200 nm) Figure 1 The exosomes stained by osmium tetraoxide(Bar=200 nm)
图2 磷钨酸负染色外泌体(Bar=200 nm) Figure 2 The exosomes stained byphosphotungstic acid(Bar=200 nm)
图3 钼酸铵负染色外泌体(Bar=200 nm) Figure 3 The exosomes stained byammonium molybdate(Bar=200 nm)
图4 醋酸双氧铀负染色外泌体(Bar=200 nm) Figure 4 The exosomes stained by uranyl acetate(Bar=200 nm)
3 讨 论
外泌体是1983年由Johnstone等[9]在绵羊网织红细胞中首次发现，其主要来源是细胞内溶酶体内陷形成多囊泡体，多囊泡体与细胞膜融合然后释放到胞外基质。外泌体的分泌过程与细胞的种类和生理或病理状态有关，并且受到靶向装载的内容物和内容物装载分子机器的调控。其分子机器主要由胞内体运输装载复合体(endosomal sorting complexes required fortransport，ESCRT) 和相关蛋白(VPS4、VTA1、ALIX)组成，其中ESCRT由4个不同作用的亚单位参与构成: 使内容物聚积的ESCRT-0、介导界膜凹陷出芽的ESCRT-Ⅰ/ESCRT-Ⅱ以及诱导囊泡脱落的ESCRT-Ⅲ。此外，外泌体还有非ESCRT依赖途径的细胞生成，在缺乏重要的ESCRT成分时，细胞可以通过脂质、四跨膜蛋白或热休克蛋白相关的不同方式形成外泌体[10]。随着越来越多的研究深入其中，实验发现外泌体是细胞间信息交流的重要载体，通过释放信号分子或者通过膜融合释放信号物质进入靶细胞，从而改变受体细胞基因表达，进而影响靶细胞生物学功能[11]。外泌体来源的细胞类型不同，其功能也不同，它们参加很多机体活动的调节，如免疫应答、细胞迁移和分化以及肿瘤侵袭等。有研究证实来自肿瘤的外泌体可以参与肿瘤细胞和基底细胞之间的遗传信息交流，有可能使血管过度增生，从而促进肿瘤生长和侵袭[12]。另外，有研究显示肿瘤细胞来源的外泌体输送到远端细胞后，外泌体能够使遗传内容物得以完整保存，从而在受体细胞中发挥重要的调节作用，通过这种非细胞间接触的方式显著促进小胶质细胞介导的炎症反应[13]。除了上述方面的进展外，外泌体在治疗方面的应用研究也有很大的拓展。在机体发病过程中细胞释放产生的外泌体，其包含的内容物组分发生一些变化后，可使得外泌体膜表面或者内部携带特定的蛋白质，以用于靶向识别病变细胞，使得利用外泌体对致病细胞进行靶向治疗有了很大的可行性。有实验表明，外泌体作为载体在治疗阿尔茨海默病、心肌缺血性再灌注损伤等方面能获得较好的治疗效果[14]。
在对外泌体的研究中，负染色后进行透射电镜观察是研究外泌体形态最常用的实验方法。负染色样品不需经过固定、脱水、包埋和超薄切片等复杂的透射电镜样品制备操作，而是将样品匀浆悬浮液直接进行染色。负染色技术优点明显：操作简单快速，染液用量非常少，分辨率较高。因此，广泛应用于细菌、病毒及一些大分子结构的研究中，是一项很重要的实验技术。其原理是利用高密度的、在透射电镜下不显示结构的重金属盐(如磷钨酸、四氧化锇等)，将生物标本包围起来，增强了背景散射电子的水平，吸附了重金属盐的样品的细微结构在黑暗的背景上显示阴性反差。负染色方法有滴染法和漂浮法。滴染法是用一根毛细吸管吸取一滴样品悬液滴在有膜的铜网上，静置数分钟，用滤纸从铜网边缘吸去多余的液体，然后滴上负染色液，染色1～2 min用滤纸吸去负染色液，干燥后可用于电镜观察。漂浮法是将带有样品悬浮液的带膜铜网在负染色液的液滴上漂浮，在漂浮期间染色液被吸附在铜网的支持膜上，经多次染色对比发现，漂浮染色3次效果最佳，具体操作为前2次漂浮染色时间迅速，最后1次漂浮染色停留1 min，然后干燥观察。此外，铜网支持膜的选择也很重要，生物大分子样品或病毒样品最好使用碳膜作支持膜。使用其他支持膜，在电镜观察时经常会发生样品漂移，造成拍摄照片困难，故本实验选择的是碳膜铜网。本研究对比了四氧化锇、磷钨酸、钼酸铵和醋酸双氧铀4种负染染液对外泌体的不同染色效果，发现醋酸双氧铀染色效果最佳，钼酸铵次之。本实验之所以选择四氧化锇作为染液之一，是因为考虑到外泌体富含胆固醇和鞘磷脂，而四氧化锇能固定脂蛋白，使生物膜结构的主要成分林脂蛋白稳定，同时又有较强的电子散射能力。但实验并未出现预期效果，染色背景出现大量泡状结构，外泌体周围也被泡状物质包围，这种现象可能与电子束与四氧化锇染液作用有关，具体机制尚不明确。磷钨酸作为常规负染染液，对外泌体的染色效果不如醋酸双氧铀和钼酸铵，外泌体的胞膜边缘不清晰，染色背景中有不明物质，形状不规则，其中圆形不明物质不能与外泌体进行明显区分。钼酸铵常用于病毒的负染色，本实验中对外泌体的染色效果也较好，其囊泡的膜结构较清楚，外泌体的杯托状结构可较清楚见到，但是反差较弱。醋酸双氧铀染色下，外泌体典型的杯托状或圆盘状结构清晰可见，膜边缘锐利，染色背景干净，反差效果佳，是最合适的负染染液。
近几年，外泌体在临床应用方面的研究不断获得新的拓展，针对肿瘤、糖尿病、心脑血管疾病、神经退行性病变等重大疾病，以外泌体为基础的研发均取得了较为明显的进步。但是外泌体种类繁多，具体的作用机制尚不明确，需对外泌体进行更深入的研究，以便为外泌体在临床的应用提供更广阔的研究思路。虽然透射电镜鉴定外泌体简便直接，但仍有一些不足需要改进，如样本脱水过程易使外泌体形态改变[15]。使用冷冻电子显微镜直接观察外泌体，可以不通过染色及化学固定，外泌体的生物活性得以最大程度保存，结合断层成像和图像的三维重构技术，可观察到外泌体更复杂的结构[16]。
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