肺癌是临床上发病率和病死率极高的一类恶性肿瘤疾病，其与吸烟、环境污染等多种因素有关[1]，以非小细胞肺癌最为常见，约占85%，严重威胁着人类健康。肺癌患者早期症状多较隐匿，多数确诊时已进展至中晚期失去手术机会，此时主要依赖传统化疗、放疗或综合治疗等。尽管化疗有一定的作用，但中位生存期几乎不超过1年，且2种化疗药物联合治疗效果也不理想，给患者的临床治疗和改善预后带来了极大的困难，故开发新的更有效的药物是目前研究的热点。随着对癌症发生发展分子机制的不断深入，研发出了针对癌症发展相关信号通路的治疗药物，通过阻断肿瘤细胞增殖的相关分子活性、信号途径和代谢过程切断肿瘤细胞的诱导、增殖和转移活性，实现对癌细胞的杀灭作用，这种药物治疗比常规的化疗药物更具有选择性，称为分子靶向治疗，是一种新型的有效治疗肺癌的方法[2]。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是目前肺癌分子靶向治疗的重要研究方向之一，其能启动细胞内信号传导，调节细胞正常活动，对于细胞的增殖、分化、迁移凋亡和黏附等起到关键作用[3-5]。在肿瘤细胞中，EGFR通常会发生突变或表达显著升高，同时肿瘤细胞自噬作用明显异常。自噬在机体的病理和生理过程十分常见，其对于维持细胞的稳定具有重要作用[6]。目前，肺腺癌肿瘤细胞中EGFR的过表达和突变与细胞自噬关系的研究尚不多见，本研究通过EGFR不同基因状态，分析其对细胞自噬活性及LC3、Beclin1基因表达的影响，以期为肺腺癌的病理生理机制研究和临床治疗提供有效依据。
1 资 料 与 方 法
1.1 细胞系来源 收集2016年7月—2018年7月在河北医科大学第四医院癌检中心诊断为肺癌的100例患者的胸腔积液，男性58例，女性42例，年龄50～79岁，平均(61.7±2.4)岁。患者均经免疫细胞化学染色和HE染色诊断为非小细胞肺癌。排除标准：①术前接受过放、化疗等治疗；②排除其他恶性肿瘤等。
本研究经医院伦理委员会批准通过；获取样本前均向患者或家属告知详情并签署知情同意书。
1.2 主要试剂 Western-Blot试剂盒及其配套试剂由北京Solarbio科技技术有限公司提供，Real Time PCR引物由美国Invitrogengon公司提供，试剂盒购自美国Promega公司。鼠抗人EGFR单克隆抗体、鼠抗人LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ单克隆抗体、鼠抗人Beclin1单克隆抗体及鼠抗人GAPDH单克隆抗体均购自美国abcam公司。
1.3 ARMS实时定量荧光PCR 常规提取胸腔积液细胞DNA，4 ℃保存待用。以超纯水作为阴性对照组，取EGFR阳性对照与8联PCR反应条、热启动TaqDNA聚合酶快速离心。将提取的DNA样本、EGFR阳性对照和超纯水各40 μL，加入4 μL热启动TaqDNA聚合酶，混匀，离心10 s。将混好的各样品取5 μL依次加入到8联PCR反应条中，盖好条管盖，离心。PCR反应条件：第一阶段，95 ℃ 5 min，1个循环；第二阶段，95 ℃ 20 s，62 ℃ 20 s，15个循环；第三阶段，95 ℃ 20 s，60 ℃ 40 s，31个循环。通过突变信号CT值与外空信号CT值计算突变情况，△CT值=突变信号CT值-外控信号CT值。突变含量≥1%为阳性，<1%为阴性，依据检测结果将所有患者分为突变组40例和非突变组60例。
1.4 Western Blot检测蛋白表达情况 收集各组细胞1×105个，采用WIP裂解液(购自北京博奥森生物技术公司)裂解，并用二奎琳甲酸试剂盒测定蛋白浓度。取60 μg蛋白样品加入到SDS-PAGE加样孔中，100 V电泳120 min。应用Bio-rad公司湿式转膜装置转膜60 min，转膜电流300～400 mA。用含8%脱脂奶粉的TBST封闭液封闭2 h，加入1抗，4 ℃孵育过夜，TBST冲洗3次，加入二抗，37 ℃孵育2 h，TBST冲洗3次，用化学发光试剂盒检测EGFR、Beclin1、LC3蛋白表达。经凝胶成像仪LAS4000显影，计算相对蛋白表达量，相对蛋白表达量=目的蛋白灰度值/β-actin。
1.5 Real Time PCR检测RNA表达情况 RT-PCR引物由Invitrogen公司合成，Nuclease Free Water稀释引物至终浓度10 mol/L。扩增条件为95 ℃ 10 min预变性，95 ℃ 15 s，59 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s，共40个循环，溶解曲线95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。终产物-20 ℃保存。反应体系20 μL，上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，Nuclease Free Water 7.2 μL，GoTaqqPCR Master Mix，2×10 μL。取1 μL存储液，以无菌水作对照，紫外分光光度计260 nm下测定吸光度值。RT-PCR引物序列见表1。
表1 RT-PCR引物序列
基因序列EGFR前端5′-GTGACCGTTTGGGAGTTGAT-3′后端5′-GGGCGACTATCTGCGTCTAT-3′LC3前端5′-ATGCCGTCGGACAAGACCTT-3′后端5′-TTACACTGACAATTTCATCCCG-3′Beclin1前端5′-GGAAGTTTTCCGGCGGCTA-3′后端5′-CATGGTGCTGTTGTTGGACG-3′GAPDH前端5′-CACCATCTTCCAGGAGCGAG-3′后端5′-CCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′
1.6 统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件分析数据。计量资料比较采用两独立样本的t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 HE染色和免疫细胞化学染色结果 HE染色结果显示，细胞成团分布，呈浅红色，形态大小差异大，细胞核大小不一，呈紫色，染色质粗糙，形状不规则，核浆比明显增大(图1)。免疫细胞化学染色结果显示，NapsinA在肺腺癌细胞浆广泛表达，呈棕褐色颗粒分布(图2)，TTF-1在肺腺癌细胞核广泛表达，呈成棕褐色(图3)。
图1 肺腺癌细胞常规HE染色
A.×200；B.×400
图2 肺腺癌胸腔积液NapsinA抗体阳性(细胞免疫细胞化学染色)
A.×200；B.×400
图3 腺癌胸腔积液细胞TTF-1抗体阳性(细胞免疫细胞化学染色)
A.×200；B.×400
2.2 2组EGFR蛋白及mRNA表达比较 ARMS实时定量荧光PCR结果显示，有40例患者出现EGFR突变。EGFR 突变组EGFR蛋白和mRNA表达水平明显低于EGFR非突变组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
表2 2组EGFR蛋白及mRNA表达比较 
组别 例数EGFR蛋白EGFR mRNAEGFR 突变组 400.39±0.020.09±0.01EGFR 非突变组600.63±0.070.91±0.15t值 25.06742.204P值 0.0000.000
2.3 2组LC3、Beclin1蛋白表达比较 Western Blot结果显示， EGFR突变组自噬相关基因LC3和Beclin1蛋白表达水平均显著高于EGFR 非突变组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。
表3 2组LC3、Beclin1蛋白表达比较
组别 例数LC3Beclin1EGFR 突变组 402.85±0.130.88±0.08EGFR 非突变组601.86±0.160.60±0.06t值 32.59718.878P值 0.0000.000
2.4 2组LC3、Beclin1 mRNA表达比较 RT-PCR结果显示，EGFR突变组自噬相关基因LC3和Beclin1 mRNA表达平均显著高于EGFR 非突变组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。
表4 2组LC3、Beclin1 mRNA表达比较
组别 例数LC3 mRNABeclin1 mRNAEGFR 突变组 400.11±0.030.10±0.05EGFR 非突变组600.06±0.040.04±0.03t值 6.7386.816P值 0.0000.000
3 讨 论
肺癌的发生发展是多因素影响及多种信号通路参与导致的肺部恶性进展性疾病，其中靶点阻断信号转导治疗肺癌已经成为当下肺癌治疗的热点研究。EGFR是一种HEB/ErbB家族络氨酸激酶型受体，与HER2、HER3及HER4一起组成ErbB家族，其本质是相对分子质量在170 000左右的穿膜糖蛋白，EGFR在非小细胞肺癌等多种上皮源性肿瘤(45%～70%)中存在过度表达情况[7]，与肿瘤细胞血管生成、侵袭、增生及转移等关系密切[8]。有研究显示，EGFR作用于细胞信号传导通路，激活时可导致肿瘤细胞的酪氨酸蛋白激酶活化及受体自身磷酸化，促进细胞的分化增生、肿瘤内的血管生成、凋亡抑制及肿瘤转移[9]。在众多肿瘤细胞中存在自噬活性的明显变化，致使肿瘤细胞的增殖、扩散能力明显增强。自噬是真核细胞中细胞初级溶酶体处理内源性底物的生理过程，对于维持细胞内环境稳定和蛋白代谢平衡均有十分重要的作用。
本研究结果显示，EGFR 突变组EGFR的蛋白和mRNA表达水平明显低于EGFR 非突变组，差异有统计学意义(P<0.05)。表明EGFR 突变能有效降低EGFR的蛋白和mRNA的表达水平，实现了EGFR基因转录后沉默效应。EGFR基因突变是肺癌靶向治疗的有效预测因子，能够显著提高肺癌的临床治疗效果。EGFR基因突变主要为21号外显子L858突变及19号外显子缺失。EGFR基因在机体多种细胞的生长中发挥了关键作用，缺少EGFR信号可导致集体皮肤受损后表皮生长受限，皮肤难以正常愈合。有研究认为，EGFR基因突变与血清肿瘤标志物、患者性别、肿瘤组织学类型等有着密切关系[10-11]。因此，EGFR突变促使肺腺癌细胞受限，加速细胞自噬。
自噬活动及其相关基因的表达与肿瘤的发生发展有着密切关系，细胞自噬和凋亡通过分子调控机制相互协调转化。LC3是哺乳动物细胞中酵母Atg8基因的同源物，定位于自噬泡膜和前至噬泡表面的活性蛋白，是特异性自噬性标志蛋白，在自噬体的形成中发挥了重要的作用[12]。Beclin1基因是酵母自噬基因Atg6/Vps30的同源基因，编码450个氨基酸。Beclin1是介导其他Atg蛋白定位于前自噬小体的重要因子，在自噬体形成早期发挥了重要的作用[13]，其能与Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶结合，是自噬活动开始的重要标志蛋白。本研究结果显示，EGFR突变组自噬相关基因LC3和Beclin1蛋白表达水平显著高于EGFR 非突变组，EGFR突变组自噬相关基因LC3和Beclin1 mRNA表达水平显著高于EGFR 非突变组，差异有统计学意义(P<0.05)。LC3分为LC3A、LC3B和LC3C 3种亚型，其中LC3B型与自噬关系最为密切[14]，每种亚型均存在Ⅰ型和Ⅱ型，通常细胞转录翻译合成的LC3最终形成LC3-Ⅰ。在自噬过程中LC3-Ⅰ经过加工修饰，并与磷脂酰乙醇胺结合形成LC3-Ⅱ，LC3-Ⅱ生成时自噬小体形成的重要标志[15-16]。EGFR转染组LC3在表达水平明显升高，提示EGFR的表达降低导致了LC3水平升高。有研究证实，Beclin1等位基因缺失在各种恶性肿瘤细胞中普遍存在，Beclin1异常表达与肿瘤进展和预后不良有着明显相关性[17]。随着EGFR通路的作用机制研究的不断深入，发现活化的EGFR使得Beclin1酪氨酸磷酸化调节自噬，且EGFR-TKI可抑制EGFR突变的NSCLC细胞中Beclin1磷酸化，进而诱导自噬发挥抑制肿瘤细胞生长的作用[18]。本研究结果显示EGFR突变组Beclin1明显升高，表明EGFR与Beclin1表达相反，说明EGFR突变能够抑制肿瘤进展，改善患者预后。
综上所述，EGFR与肺腺癌细胞自噬活性存在明显的相关性，EGFR突变可以增强肺腺癌细胞自噬活性，增加自噬相关基因LC3和Beclin1的表达，这对于肺腺癌的临床研究和靶向治疗具有十分重要的意义。
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