抑郁症是一种人群中具有较高流行性的精神疾病，患者通常表现为诱因不充分的情绪低落，且低落状态具有一定的持续性[1]。抑郁症的诱发因素广泛而复杂，而且诱发抑郁症的矛盾大多属于内源性，即通常外界环境改变的刺激很难对抑郁症患者形成非常明显的疗效[2]。基因多态性是生物群体中存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因的现象，亦称遗传多态性， 其本质是基因水平的变异，一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要调节功能的区域[3]。对于个体而言，基因多态性碱基顺序终生不变，并按孟德尔规律世代相传。疾病基因多态性与临床表型多样性的联系已受到重视，如肿瘤等多基因病的临床表型往往多样化，基因型与表型之间的联系对探索疾病的发生机制、预测疾病的转归等均具有重要意义[4]。据研究报道，5-羟色胺转运体SLC6A4基因与多种精神类病理性情感变化存在相关且不存在明显的人群聚集性[5]。说明研究结论的外推性已经得到流行病学层面的验证，但其具体作用机制有待进一步探讨。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置发生了转换、颠倒、缺失和插入等变化而引起的序列多态性，同时单核苷酸多态性具有数量大、分布广、稳定性强、易于分型等优点，5-羟色胺转运体SLC6A4基因多态性在精神卫生类疾病的诊断及治疗、致病基因的发现、族群的演化研究等方面起到了重要作用[6-7]。因此，本研究拟针对抑郁障碍与5-羟色胺转运体SLC6A4基因多态性进行生物信息学及分子流行病学层面的相关性分析。
1 资 料 与 方 法
1.1 一般资料 收集2017年5月—2018年1月在内蒙古自治区精神卫生中心接受治疗的抑郁症患者203例，男性79例，女性124例，年龄32～54岁，平均(42.08±8.17)岁。本研究采用随机原则进行研究对象的选取，在告知受试对象研究目的并取得其同意签字后方进行研究。本研究中所有健康人群(无抑郁)共228例，男性109例，女性119例，年龄30～56岁，平均(43.09±8.02)岁。2组性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。
1.2 抑郁症判定标准和剔除标准 抑郁症的判定标准采用专门的《抑郁自评量表》[8]，该量表包含20个条目，按照中国常模结果，该量表标准分的分界值为53分，其中53～62分判定为轻度抑郁，63～72分判定为中度抑郁，72分以上判定为重度抑郁。如下情况的受试者需剔除：①存在交流障碍；②有吸毒史；③1年内接受过同类型研究。最终纳入有效研究对象203例。
本研究经医院医学伦理委员会批准。
1.3 研究方法
1.3.1 查询 利用NCBI中的Gene获得已有文献报道的抑郁情感障碍人群SLC6A4基因所有的SNP位点；再利用人类基因组数据库ENSEMBLE，获得大众人群SLC6A4基因所有的SNP位点。SLC6A4统计学分析：对所得的人群和大众人群的SLC6A4所有SNP位点进行归类统计和特征分析。
1.3.2 SLC6A4同源基因的序列比对与进化树分析 ①同源基因获取：利用NCBI中的HomoloGene数据库可查询得到。②同源基因的序列比对：将获取的物种序列文件导入BioEdit软件，利用其附带的ClustaW多重序列比对工具，进行同源基因比对。③进化树分析：利用之前BioEdit比对好的序列，运用MEGA软件，选择最大似然法则，构建系统发生树，进化分析结果可显示出人类SLC6A4基因与其他物种的同源关系强度。
1.3.3 SNP与抑郁情感障碍相关潜在位点分析 ①筛选SNP位点：第一步，根据突变发生类型，初筛人群中SLC6A4基因所有的SNP位点，得到发生非同义突变的SNP位点；第二步，根据突变对蛋白质结构功能的影响，筛选大众人群中SLC6A4基因所有的SNP位点，得到对蛋白质结构功能造成破坏的SNP位点；第三步，结合2次筛选结果，得到对蛋白质结构功能造成破坏的SNP位点。②找寻保守氨基酸：在同源基因序列比对的结果中，比较从斑马鱼(数据库中记录的最低等生物)到人类的SLC6A4蛋白序列，确定氨基酸种类保持不变的序列位置，从而到保守氨基酸(保守氨基酸，是指在物种进化过程中，该蛋白序列某位置上的氨基酸种类保持不变，即保守性为100%)。③对比分析：结合得到的保守氨基酸序列，在筛选出的SNP位点中找寻相应的突变点，最终获得关键的SNP位点。
1.3.4 分子流行病学验证方法 聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增：取患者空腹静脉血10 mL，3 000 r/min离心取上清，等量分装为4份于-20 ℃低温环境下保存以供不同检测所需。用20 μL TE缓冲液溶解后采用PCR法检测标本中mRNA的存在。PCR反应具体条件：根据NCBI中Genbank库的相关基因序列生物信息学数据设计引物，由上海其明生物有限公司合成。上游引物序列为：5′-GTTCAGGTAGCGATGAGCTA-GCAAC-3′；下游引物序列为：5′-CTGCATGCA-GTGAGCAGAGAGCGTC-3′；引物长度592 bp；反应温度：95 ℃，60 s/55 ℃，30 s/75 ℃，60 s，持续40个循环后于75 ℃条件下延伸10 min。试剂盒中所提供探针均为SLC6A4基因突变探针与内参基因探针2种荧光探针的混合物，每个反应中检测通道设置按说明书进行。
Western blot验证：扩增产物采用Western blot法进行蛋白产物的定性和定量分析。具体步骤：①将电泳后的凝胶从玻璃板上剥脱下来，置于煮胶盒，加入25%乙醇至乙醇浸过凝胶面为止，将煮胶盒放入微波炉，高温煮沸2.5 min，重复该步骤3次；②加入考马斯亮蓝染色液(至染色液浸过凝胶面为止)浸泡凝胶，放室温摇床缓慢振荡，均匀染色30 min至凝胶上的条带清晰可见；③用双蒸水漂洗已染色的凝胶后，加入5%的醋酸与25%乙醇混合液，脱色摇床缓慢摇动1 h左右至染色液基本洗脱为止；④脱色完毕后，将凝胶用双蒸水冲洗，置于凝胶图像扫描分析仪上观察结果，经图像软件处理后拍照保存。
1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验；采用Hardy-Weinberg平衡检验结果判定样本的群体代表性。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 基因型分析 按照生物信息学方法分析得到2个符合研究要求的SNP位点，分别为rs25531及5-HTTLPR，PCR扩增产物测序后共发现7种基因型，分别为SASA468bp，SASG468bp、100bp，SALA468bp，SALG468bp，LALA468bp，LALG 468bp，LGLG468bp，见表1。
rs25531及5-HTTLPR的Western blot结果见图1。
表1 rs25531及5-HTTLPR两倍点单倍型分布 (例数)
组别例数SASASASGSALASALGLALALALGLGLG无抑郁 2282081321121轻度抑郁6452131511中度抑郁6757201412重度抑郁7263012510χ2值17.563P值0.485
图1 rs25531及5-HTTLPR的Western blot结果
1.DNA Marker；2.SASA;3.SASG;4.SALA;5.SALG；6.LALA;7.LALG;8.LGLG
2.2 rs25531及5-HTTLPR两倍点单倍型分布 分析rs25531及5-HTTLPR两倍点等位基因单倍型发现，2个位点共构成4种单倍型(S-A、S-G、L-A、L-G)，两倍点等位基因单倍型在不同抑郁等级组之间的差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。
2.3 各组在rs25531及5-HTTLPR位点的基因型和等位基因分布 rs25531和5-HTTLPR位点上基因型和等位基因在不同抑郁等级人群当中的分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。
表2 rs25531及5-HTTLPR两倍点单倍型分布情况
组别例数S-AS-GL-AL-G无抑郁 2284221276轻度抑郁641091144中度抑郁67117296重度抑郁721290123χ2值14.458P值0.107
表3 各组rs25531及5-HTTLPR位点上基因型和等位基因分布
组别例数s25531基因型GAGGAAs25531等位基因GA5-HTTLPR基因型SLLLSS5-HTTLPR等位基因SL无抑郁 2286202024641051920441343轻度抑郁641 75615113175611313中度抑郁672 75816118185811717重度抑郁72486020124396012321χ21值=2.765 χ22值=1.396 χ23值=6.525χ21值=3.073 χ22值=2.020 χ23值=3.440P1值=0.838 P2值=0.707 P3值=0.089P1值=0.800 P2值=0.568 P3值=0.329
注：χ21值与P1值代表AA/GA/GG(SS/LS/LL)基因型比较结果；χ22值与P2值代表GA+GG(SL+LL)基因型比较结果；χ23值与P3值代表等位基因比较结果
3 讨 论
大量的证据表明抑郁症具有基因流行病学病因基础，基因组连锁分析和全基因组关联研究均支持易于发生的基因致病因素理论；近年来有很多针对抑郁症的基因关联性研究，其中包括对5-羟色胺再摄取抑制相关机制的研究和分析[9-10]。本研究联合生物信息学及分子流行病学方法分析SLC6A4与抑郁障碍的关系，结果显示rs25531及5-HTTLPR基因多态性在不同抑郁等级人群当中的分布差异均无统计学意义。与相关研究报道的结果有一定相似性[11-14]。从对生物的遗传性状的影响上来看，SNP又分为2种：一种为同义SNP，它所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨基酸序列，突变碱基与未突变碱基的含义相同，在本研究中分析rs25531及5-HTTLPR两倍点等位基因单倍型的过程中，两倍点等位基因单倍型在不同抑郁等级组之间的差异无统计学意义，说明不同分型的两倍点等位基因单倍型患者的rs25531及5-HTTLPR的蛋白表达产物并无本质上的不同；另一种为非同义SNP占 50%左右，指碱基序列的改变可使翻译的蛋白质序列发生改变，从而影响了蛋白质的功能，这种改变常是导致生物性状改变的直接原因[15]。表明rs25531及5-HTTLPR发生同义突变的可能性相对较大。
本研究结果还显示SLC6A4中突变率较高的2个位点rs25531及5-HTTLPR基因多态性在不同抑郁障碍人群间差异无统计学意义。由于诸多研究报道SLC6A4在多种精神疾病的发生发展中具有重要意义[3,11-14]，故其SNP在人群中的突变体可能有潜在疾病的高风险，但就疾病发生机制而言，SNP与抑郁障碍的发生尚未确定直接的因果关系。有学者发现位于人类5-羟色胺受体D2上的同义突变C957T可以改变mRNA的构象[9]，从而降低mRNA的稳定性和翻译效率，导致5-羟色胺介导的5-羟色胺受体D2的表达减少，且该现象与精神分裂症和酒精中毒的发病有关，故同义突变也可能通过转录、转录后水平，翻译及翻译后修饰等多环节中某些步骤影响蛋白质的功能而导致疾病的发生。但从本研究得到的结论来看，虽然rs25531及5-HTTLPR均在SLC6A4中发生特异性表达，但其与表达的定性和定量结果与抑郁症发生与否尚无直接的因果关联[15-16]。
此外，本研究分析rs25531及5-HTTLPR两倍点等位基因单倍型显示，2个位点共构成4种单倍型(S-A、S-G、L-A、L-G)，两倍点等位基因单倍型在不同抑郁等级组之间的差异无统计学意义。但就本研究得到的结论来看，虽然rs25531及5-HTTLPR经PCR扩增测序后发现了7种基因型，且均表达特异蛋白，但两倍点等位基因单倍型在不同抑郁等级组之间的差异无统计学意义。说明这7种基因型并不能作为筛检抑郁情感障碍的直接依据，这种作用机制需要进一步结合遗传理论及孟德尔随机化研究进行验证。
综上所述，rs25531及5-HTTLPR基因多态性的发现虽然对于抑郁情感障碍的筛检具有一定意义，但其因果关系及判定价值仍需进一步验证。
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