胰岛素抵抗是多种代谢相关疾病如糖尿病、高血压病及冠心病等的共同危险因素[1]，其治疗机制是目前研究热点之一。运动是糖尿病治疗的五大处方之一，其有助于改善胰岛细胞功能和胰岛素抵抗，降低血糖水平，其机制可能与调节过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor-γ，PPAR-γ)表达密切相关。本课题组前期研究表明，运动可以上调肝脏、骨骼肌中PPAR-γ的表达和骨骼肌中葡萄糖转运体4 mRNA的表达，从而调节糖代谢[2]，但其具体分子机制仍不十分明确。丙酮酸脱氢酶激酶4(pymvate dehydrogena kinase 4，PDK4)和丙酮酸脱氢酶 (pyruvate dehydrogenase，PDH)是参与糖代谢的重要酶系[3]。PDK2/PDK4基因各包含2个PPAR反应元件，表明PDK4是PPAR的下游靶基因之一，可能参与PPAR调控糖代谢过程[4]。目前，有关运动对胰岛素抵抗状态下PPAR-γ与糖代谢相关酶PDK4、PDH之间的关系国内未见报道。因此，本研究采用高脂饮食建立小鼠胰岛素抵抗模型，观察游泳运动对胰岛素抵抗小鼠肝脏组织PPAR-γ、PDK4和PDH mRNA表达的影响，旨在探讨游泳运动改善小鼠胰岛素抵抗的机制，报告如下。
1 材 料 与 方 法
1.1 动物分组及动物模型的建立 采用随机数字表法将31只健康清洁8周龄雄性C57BL/6J小鼠分为正常组(n=10)、高脂组(n=10)和运动组(n=11)。正常组给予基础饲料， 高脂组和运动组给予高脂饲料(0.21%胆固醇和21%猪油)[5]，运动组给予游泳训练进行干预。正式运动前适应性运动1周，具体运动方案为每天训练60 min，每周5次，训练12周[6]。游泳池水温(35±1) ℃，水深38 cm。
1.2 取材与方法 干预12周后，禁食12 h过夜，次晨称重后取眼球血，分离血清后-20 ℃冷存用于测定血胰岛素含量。在无菌火酶条件下剪取100 mg肝右叶，-80 ℃保存以备后续逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)检测；另取肝脏左叶切成8 mm 厚的组织块，常规石蜡包埋切片，以备光镜和电镜下观察形态结构。
1.2.1 空腹血糖(fasting blood glucose，FBG)、胰岛素(fasting insulin，FINS)和胰岛素抵抗指数(insulin resistance index，IRI)的计算 用快速血糖仪测量FBG并记录，放射免疫法测量FINS，并计算IRI，IRI=[FBG(mmol/L)×FINS(mU/L)]/22.5。
1.2.2 肝脏组织样品的制备和观察 取肝脏左叶以2.5%戊二醛，固定24 h以上，2%饿酸固定2 h，分别行50%、70%、90%、100%丙酮脱水，每级10 min×3次梯度脱水。经浸泡、包埋成块、修块、定位、超薄切片后进行HE染色和电子醋酸铀、硝酸钳双重染色，光镜和透射电镜观察并照片。
1.2.3 肝组织中PPAR-γ、PDK4和PDH mRNA的检测 取肝脏组织50 mg，置于盛有液氮的研钵中，迅速将组织研磨成粉末状，加入Trizol(50 g/L Trizol计算，样本体积不超过Trizol体积的10%)，按照说明提取总RNA，紫外分光光度计测定A260/A280比值，检验纯度，A260/A280比值在1.8～2.0之间。根据GeneBank中查得小鼠目的基因mRNA序列，再通过Primer Premier 5软件设计引物，按照逆转录盒上步骤进行逆转录操作。取cDNA 4 μL作为模板，依次加入100 μm上游引物和下游引物各0.5 μL，2×TaqPCR MasterMixl 2.5 μL，总反应体系为10 μL。2.5%琼脂糖凝胶中加入溴乙锭(10 g/L)使其终浓度为0.5 mg/L，成胶后置于电泳槽，加入0.5×TBE缓冲液，取5 μL PCR产物与l μL载样缓冲液混匀点样，在60 V恒压下电泳40 min。TANON GIS2020凝胶分析仪数码拍照，应用Image-proplus 6.0图像分析软件对结果进行半定量分析。
1.3 统计学方法 应用SPSS 16.0统计软件处理数据。计量资料比较分别采用配对t检验、F检验和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 3组小鼠游泳训练干预前后体重比较 干预前，3组小鼠体重差异无统计学意义(P>0.05)；干预12周后，3组体重均大于干预前，高脂组体重显著大于正常组和运动组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 3组干预12周前后体重比较
Table 1 Weight comparison of three groups before and after 12 weeks intervention 
组别小鼠数体重干预前干预后正常组1020.80±2.4026.80±2.50∗#高脂组1020.50±2.6030.00±2.40∗运动组1121.00±2.2027.00±2.20∗#F值0.54416.945P值0.5860.000
*P值<0.05与干预前比较(配对t检验) #P值<0.05与高脂组比较(SNK-q检验)
2.2 3组FINS、FBG、IRI比较 干预12周后，高脂组和运动组FINS、FBG、IRI明显高于正常组，运动组FINS、FBG、IRI明显低于高脂组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表2。
表2 3组FINS、FBG、IRI比较
Table 2 Comparison of FINS,FBG and IRI in three groups 
组别小鼠数FINS(mU/L)FBG(mmol/L) IRI正常组105.14±2.42 6.91±2.421.69±0.87高脂组1014.00±7.12∗ 9.49±1.28∗5.92±3.24∗运动组1110.17±3.88∗#8.03±1.67∗# 2.57±1.17∗#F值 38.62022.79473.620P值0.000 0.000 0.000
*P值<0.05与正常组比较 #P值<0.05与高脂组比较(SNK-q检验)
2.3 肝脏组织形态学改变 光镜观察：HE染色可见正常组小鼠肝组织结构完整，肝细胞分界清，大小较均一，核圆而清晰，肝窦排列规则，汇管区清晰；高脂组小鼠肝细胞呈弥漫性脂肪变性，胞质内充满大量大小不等的圆形脂滴和印戒形肝细胞；运动组小鼠肝细胞结构正常，胞质内偶见脂滴形成。图1～3。
电镜观察：正常组肝小叶结构清晰，形态正常，肝细胞大小、形态正常；高脂组可见明显肝细胞脂肪变性，肝细胞肿大，胞浆内充满大小不等的脂肪空泡；运动组大部分肝细胞形态正常，少数细胞胞浆稍水肿，细胞内有脂褐素样物质(脂滴被溶酶体溶解消化后的产物)残留，未见明显脂滴。图4～6。
图1 正常组肝脏(HE ×400) Figure 1 Liver in normal group (HE ×400)图2 高脂组肝脏(HE ×400) 注:箭头示脂滴Figure 2 Liver of hyperlipidemia group (HE ×400)图3 运动组肝脏(HE ×400)注:箭头示脂滴Figure 3 Liver in exercise group (HE ×400)图4 正常组肝脏(×5 000)
Figure 4 Liver of normal group ( ×5 000)
图5 高脂组肝脏(×5 000)
注：箭头示脂滴
Figure 5 Liver of hyperlipidemia group(×5 000)
图6 运动组肝脏(×5 000)
注：剪头示脂褐素样物质
Figure 6 Liver of exercise group (×5 000)
2.4 3组小鼠肝脏PPAR-γ、PDK4、PDH mRNA表达比较 高脂组PPAR-γ mRNA表达低于正常组，运动组PPAR-γ mRNA表达高于正常组，高脂组和运动组PDK4 mRNA表达高于正常组，PDH mRNA表达低于正常组(P<0.05)；运动组PPAR-γ mRNA和PDH mRNA表达明显高于高脂组， PDK4 mRNA表达增加低于高脂组(P<0.05)。见表3。
表3 3组PPAR-γ、PDK4、PDH mRNA表达
相对光密度值比较
Table 3 Comparison of relative density of expression of PPAR-γ, PDK4 and PDH mRNA in three groups
组别小鼠数PPAR-γ mRNA PDK4 mRNAPDH mRNA正常组101.27±0.26 0.57±0.111.87±0.32高脂组100.95±0.17∗2.12±0.37∗0.68±0.24∗运动组112.37±0.41∗# 1.07±0.25∗# 1.54±0.28∗#F值311.609 418.440222.534P值 0.000 0.000 0.000
*P值<0.05与正常组比较 #P值<0.05与高脂组比较(SNK-q检验)
3 讨 论
本研究结果显示，经12周游泳训练后，与高脂组比较，运动组小鼠体重、FINS、FBG、IRI明显降低，光电镜下观察肝细胞结构正常，胞质内偶见脂滴形成，少数细胞胞浆稍水肿，胞内有脂褐素样物质残留，未见明显脂滴，且运动组肝细胞PPAR-γ mRNA、PHD mRNA表达明显增加，PDK4 mRNA明显表达降低。表明运动干预可以减轻体重，降低血糖，改善高胰岛素血症和胰岛素抵抗，其机制可能与减轻肝细胞脂肪变性、上调小鼠肝组织PPAR-γ mRNA表达、减少PDK4 mRNA表达、增加 PDH mRNA表达有关。
PPAR-γ是调节目标基因表达的核内受体转录因子超家族成员，其调节、活性或表达可能参与胰岛素抵抗发生的分子机制[7]。研究表明，PPAR-γ可增强机体对胰岛素的敏感性[8]，调节体内糖平衡，改善胰岛素抵抗。其机制一：PPAR-γ可直接激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B，增加外周组织葡萄糖转运体4基因表达，促进心肌及骨骼肌对葡萄糖的转运和摄取，减轻胰岛素抵抗[9]。运动可通过上调骨骼肌PPAR-γ及葡萄糖转运体4 mRNA表达改善胰岛素抵抗，与国外研究一致[10]。其机制二：PPAR-γ可通过调节脂肪细胞分泌的游离脂肪酸(free fatty acids，FFA)、肿瘤坏死因子、瘦素、脂联素等细胞因子改善胰岛素敏感性[11]。脂肪细胞是胰岛素作用的重要靶点和糖脂代谢的主要场所，其分泌的胰岛素抵抗密切相关细胞因子FFA会对胰岛素β细胞产生毒性，加重糖脂代谢紊乱[12]。PPAR-γ主要分布在脂肪组织中，对脂肪细胞的分化有重要调节作用[13]，从而改善脂肪细胞的胰岛素抵抗。运动显著增加PPARγ的活性已成为共识，且运动所致的PPARγ激活与其改善糖脂代谢和抑制脂肪细胞分泌的炎症有关。运动合并PPARγ激动剂罗格列酮能显著改善糖尿病大鼠骨骼肌的胰岛素敏感性，促进骨骼肌对糖的摄取[14]。本研究结果显示，高脂组胰岛素抵抗造模成功，运动组小鼠经过12周游泳训练后，电镜观察少数肝细胞胞浆稍水肿，细胞内有脂褐素样物质残帘，未见明显脂滴，FINS、FBG、IRI明显低于高脂组，肝脏脂代谢紊乱及胰岛素抵抗明显改善；且运动组肝脏组织PPAR-γ mRNA的表达水平明显高于高脂组。推测运动改善胰岛素抵抗可能与运动激活肝脏细胞PPAR-γ基因表达、减轻肝脏细胞质代谢紊乱相关。
PPAR-γ还参与糖代谢过程中某些关键酶基因的表达，如增强脂肪组织和骨骼肌中葡萄糖转运体4基因表达，以及抑制PDK4基因表达。目前人类及啮齿类动物PDK鉴定出4种同工酶，其中PDK4与长期糖脂代谢丙酮酸脱氢酶系调控有关[15]。PDK4在具有高度脂肪酸氧化能力和高水平表达脂质氧化转录因子PPAR-γ的组织中(如心脏、氧化型肌肉、肝脏等组织)高度表达，是调节葡萄糖氧化分解过程中的关键限速酶，PDK4可使PDH磷酸化而抑制其活性，阻断丙酮酸进入三羧酸循环，从而抑制葡萄糖氧化作用[16]。丙酮酸脱氢酶系是一个定位于线粒体中的多酶复合体，其活性与胰岛素抵抗密切相关。胰岛素抵抗等条件下，PDK4能够调节骨骼肌丙酮酸脱氢酶系的活性，在调节葡萄糖和脂肪酸代谢的转换中起重要作用[17]，机体通过增加PDK4活性，降低丙酮酸脱氢酶系活性，阻碍葡萄糖分解代谢，导致血糖升高。因此，通过抑制PDK4增加PDH的活性也是治疗糖尿病的靶点。Barberio等[18]开发出一种新制剂(PS10和compouND 17或PS46)，它是泛PDK抑制剂，PS10和PS46与活性部位结合，并对肝脏中的PDK活性有优先抑制作用，能有效提高丙酮酸脱氢酶系活性，故而有效降低血糖。本研究结果显示，高脂组小鼠肝脏组织PDK4 mRNA表达明显高于正常组。PDH mRNA表达明显低于正常组。表明胰岛素抵抗时存在糖代谢相关酶 PDK4 mRNA和PDH mRNA表达的异常，与国外研究结果一致[19]。本研究运动组小鼠肝脏组织PDK4 mRNA表达明显低于高脂组，PDH mRNA表达明显高于高脂组。表明游泳运动可以使PDK4 mRNA表达降低，PDH mRNA表达增加，游泳运动改善胰岛素抵抗的另一可能机制是通过调节糖代谢相关酶PDK4 mRNA和 PDH mRNA表达而实现的。
本研究初步探讨运动改善肝脂代谢及胰岛素抵抗的相关机制,其中PPAR-γ、PDK4、PDH mRNA表达为半定量分析，有一定局限性，故对于运动改善人类胰岛素抵抗相关机制尚需进一步实验研究证实。
综上所述，运动可以减少肝脏脂肪含量，改善肝脏脂代谢紊乱及胰岛素抵抗，使葡萄糖氧化分解增加，进而改善糖代谢；推测其机制可能与上调肝组织PPAR-γ mRNA的表达、抑制PDK4 mRNA的表达、增加PDH mRNA的表达有关。
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