CIAPIN1基因在膀胱癌组织中的表达及其对T24细胞增殖的调节

膀胱癌严重威胁患者的生命与健康，是泌尿生殖系统中最常见的恶性肿瘤之一[1]。尽管我国膀胱癌的发病检出率低于欧洲，但随着人口平均寿命的逐年递增，生活条件及医疗水平的提高，加之环境污染等，我国膀胱癌的发病率和检出率逐年增加，而且呈年轻化趋势[2]。细胞因子诱导的凋亡抑制因子1(cytokine-induced apoptosis inhibitor 1，CIAPIN1)是一种新型的细胞死亡抑制因子，可以对抗细胞凋亡[3]，其由N-末端区域中的甲基转移酶结构和C-末端中的类似Cx2Cx24Cx2C锌指样结构组成[4-5]。CIAPIN1可以抑制多种由刺激因素所导致的凋亡，这些刺激因素包括死亡受体的激活、生长因子的阻断、电离辐射、病毒感染和基因毒性损伤等，而且CIAPIN1还可以有效调节肿瘤的生长[3,6]。此外，通过抑制CIAPIN1在细胞中的表达，能有效逆转三阴性乳腺癌细胞的多药耐药性[7]。然而CIAPIN1在膀胱癌中的作用尚不清楚。本研究旨在通过荧光定量PCR、Western blot及细胞增殖等技术，探讨CIAPIN1在膀胱癌组织中的表达及其对细胞增殖的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料收集2012年3月—2017年12月河北省保定市第一医院泌尿外科临床手术切除的膀胱癌组织和5 cm以外的癌旁组织各98例。男性51例，女性47例；年龄39～83岁，中位年龄62岁；TNM分期Ta～T1期者(非肌层浸润性膀胱癌)51例，T2～T4期者(肌层浸润性膀胱癌)47例；肿瘤≤3 cm患者45例，>3 cm患者53例；组织学分级gradeⅠ患者48例，grade Ⅱ～Ⅲ患者50例；无淋巴结转移64例，有淋巴结转移34例。所有配对癌旁组织标本均无肿瘤残留或合并其他膀胱疾病，以上样本均有完整临床资料。

1.2 RNA提取及实时定量PCR 膀胱癌及癌旁组织(约100 mg)分别加入1 mL RNA裂解液经组织研磨管冰上裂解。细胞经PBS冲洗后直接加入1 mLRNA裂解液，总RNA的提取(参照Total mRNA Extract kit(Omiga)操作手册，Nano2000(Thermo Fisher)核酸定量仪检测RNA的纯度和浓度。按照Invitrogen公司“用于qRT-PCR的M-MLV第一链合成系统”操作说明，取5 μg总RNA建立20 μL使用随机引物逆转录体系合成cDNA。继之，使用Invitrogen公司的“Platinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG with ROX”试剂盒和ABI 7500 Fast Real-time PCR扩增仪进行荧光扩增，利用以下引物检测CIAPIN1的mRNA表达，CIAPIN1-F：5′ GAG CTG CTG GAT CCA GAA GAT TTG AAG 3′,CIAPIN1-R：5′ CAG GTA GCA GTT TCC ACA AGC TGAC 3′;GAPDH-F:5′GGG TGT GAA CCA TGA GAA GTA TGAC 3′ ,GAPDH-R:5′ GTG GTC ATG AGT CCT TCC ACG ATA CC 3′。PCR结果采用相对定量法比较Ct值，以GAPDH的Ct值为内参，采用-△Ct(Ct目的-Ct内参)法进行相对定量分析，用2-△Ct计算公式计算所得值作为目的RNA的相对表达量。

1.3 蛋白提取及Western blot 分别取膀胱癌及癌旁组织(约50 mg)加入0.5 mL 蛋白裂解液和5 μL 100 g/L PMSF蛋白酶抑制剂，冰上操作经研磨裂解。离心收集蛋白质上清液，用改良的Lowry法进行蛋白定量。取等量蛋白样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳完毕，取出凝胶进行半干转膜。转膜完毕，取出 PVDF 膜，置于含5 % 脱脂奶粉的TTBS(10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,150 mmol/L NaCl,0.05% Tween-20)封闭液中，于室温封闭2 h后进行CIAPIN1 (Proteintech ，12638-1-AP)一抗4 ℃过夜，次日二抗结合反应1 h。最后用化学发光法检测抗体结合区带，以β-actin为内参基因。

1.4 细胞培养及转染 T24膀胱癌细胞株购自 American Type Culture Collection，细胞在含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、100 U/mL青霉素和100 pg/mL 链霉素(Gibco,NY,USA)，使用RPMI 1640，于37 ℃，含5 % CO2中培养。根据CIAPIN1基因(GenBank：NM 020313.2)的核苷酸序列，设计2对干扰片段(siCIAPIN1-F1:5′ CCC UUC UUC UGA UGU UAA AUU 3′,siCIAPIN1-R1:5′ UUU AAC AUC AGA AGA AGG GUU 3′;siCIAPIN1-F2:5′ GGC UAU UCC UAC GCU UAG AUU 3′，siCIAPIN1-R2:5′ UCU AAG CGU AGG AAU AGC CUU 3′)和对照序列片段(Scramble)，由上海吉玛公司分别合成CIAPIN1 干扰的siRNA。2 ×105 T24细胞接种到六孔板中，24 h后按照LipofectamineTM 2000 说明书转染细胞。转染后24 h后分别检测CIAPIN1的表达和细胞增殖实验。

1.5 用MTS法测定细胞增殖 T24细胞2×104接种于96孔板上，待细胞充分贴壁展开后，分别转染siCIAPIN1和Scramble。6 h后换成2% FBS的RPMI 1640(此时为0 h)，T24细胞的培养基更换为含有100 μL无血清RPMI 1640和10 μL的CellTiter 96 AQueous MTS溶液(Promega公司，G3582)，放回培养箱中37 ℃培养，4 h后，轻轻振动孔板，用排枪从每个孔中取60 μL培养基转移到1个新的96孔板，用多功能酶标仪测定各个孔在490 nm处的光密度(optical density，OD)值。以没加MTS的孔作为对照。每个样本重复3次，每处理做3个复孔。之后12，24，48 h分别测定MTS值。以0 h为基线，并通过下列公式计算细胞存活率，细胞存活率(%)=(实验组OD490值/对照组OD490值)×100%，计算不同时间点的MTS值，用Graphpad prism 5软件绘制曲线图。

1.6 统计学方法应用Graphpad prism 5统计软件分析数据。计量资料比较采用两独立样本的t检验；计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CIAPIN1 mRNA在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达为了检测CIAPIN1 mRNA在临床样本中的表达情况，以同一患者的癌旁组织作为对照，采用荧光定量PCR技术检测CIAPIN1 mRNA的表达。PCR结果显示，膀胱癌组织中的CIAPIN1 mRNA表达显著高于癌旁组织(P<0.05)，见图1。

2.2 不同临床特征膀胱癌患者CIAPIN1表达阳性率比较组织学分级grade Ⅱ～Ⅲ膀胱癌患者CIAPIN1表达阳性率高于gradeⅠ，TNM分期T2～T4膀胱癌患者CIAPIN1表达阳性率高于Ta～T1(P<0.05);不同性别、年龄膀胱癌患者CIAPIN1表达阳性率差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.3 CIAPIN1蛋白在膀胱癌组织和癌旁组织中的表达为了进一步检测CIAPIN1在膀胱癌组织中的表达，随机挑选3对膀胱癌组织和对应的癌旁组织，利用Western blot检测CIAPIN1蛋白的表达，结果显示膀胱癌组织中CIAPIN1蛋白的表达水平明显高于癌旁组织(P<0.05)，其内参基因β-actin在膀胱癌组织和癌旁组织中表达均无明显变化，见图2，表2。

Figure 2 Expression of CIAPIN1 protein level in bladder cancer and paracancerous tissue

2.4 敲低CIAPIN1 基因对T24细胞增殖活性的影响荧光定量PCR检测siRNA转染T24细胞后CIAPIN1 mRNA表达，结果显示siCIAPIN1处理的T24细胞 CIAPIN1 mRNA表达水平明显低于对照组(P<0.05)。MTS结果显示，与对照组相比，随着时间延长敲低CIAPIN1显著抑制T24细胞的OD值，在0 h时，对照组与敲低组细胞的OD值差异无统计学意义(P>0.05)，12，24，48 h时敲低CIAPIN1基因T24细胞增殖活性明显低于对照组(P<0.05)，表明敲低CIAPIN1 基因表达可抑制T24细胞的增殖活性。见表3，4。

3 讨论

膀胱癌面临的最大难题是复发率和转移率高[8]。对于早期膀胱癌患者，治疗手段相对简单而且效果明显，但是对于中晚期患者，尤其是伴有局部扩散或远处转移者，大多采用膀胱内灌注或肿瘤内注射的方法，效果并不明显[9]。因此，要想提高患者的治愈率，早期的发现是有效手段之一[10]。筛选膀胱癌的标志基因，深入研究膀胱癌的发病机制，将有助于从基因水平寻找膀胱癌的发病原因[10]，这对膀胱癌的诊治至关重要。

CIAPIN1是一种新型的细胞死亡抑制因子，可以对抗细胞凋亡[11]。CIAPIN1位于人染色体16q13，包含8个外显子和7个内含子。CIAPIN1的编码序列包含939 bp，编码312个氨基酸，相对分子质量为16 500。然而，近年来发现CIAPIN1作为一个肿瘤进展基因在调节细胞增殖中发挥重要作用[12]。本研究结果显示，敲低CIAPIN1可显著下调膀胱癌T24细胞的增殖，说明其可能在膀胱癌的发展过程发挥促增殖作用。

在大多数人类实体瘤和血液恶性肿瘤中均会发现CIAPIN1表达上调[6,13]。甚至在多种良性肿瘤和癌前病变组织中可以检测到CIAPIN1表达变化[14]。但是也有研究报道，CIAPIN1在胃癌和肾透明细胞癌中表达水平降低[15-16]。这些均表明CIAPIN1在肿瘤病变及发展过程中的重要地位，因为不同的组织或器官有不同的调控机制以及不同的基因表达水平或层次，故更值得对CIAPIN1在癌症发生发展过程中的机制进行研究。本研究荧光定量PCR结果显示，膀胱癌组织中CIAPIN1基因转录水平显著高于癌旁组织(P<0.05)；Western blots结果显示，膀胱癌组织中CIAPIN1蛋白质表达水平上调(P<0.05)。表明CIAPIN1表达水平可能与膀胱癌发展程度存在相关性，故可以作为患者预后是否良好的重要标记之一。Wang等[17]发现，CIAPIN1可抑制多发性骨髓瘤的生长和增殖，监测CIAPIN1的表达可以了解病情的发展。CIAPIN1也是转移性卵巢浆液性癌中存活不良的标志基因[13]。

综上所述，CIAPIN1 mRNA及蛋白质在癌组织中表达水平显著上调；而细胞功能研究发现，敲低CIAPIN1后显著抑制T24细胞的增殖，表明CIAPIN1可能作为膀胱癌进展的重要标志基因。

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CIAPIN1基因在膀胱癌组织中的表达及其对T24细胞增殖的调节

1 资 料 与 方 法

2 结 果

3 讨 论

Expression of CIAPIN1 gene in bladder cancer and its regulation on the proliferation of T24 cells

1 资料与方法

2 结果

3 讨论