近年来，随着我国二胎政策放开之后，有很多高龄妇女计划再次妊娠，但是由于年龄等各种因素导致生育能力下降，故希望通过体外受精-胚胎移植技术(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)实现受孕的人也越来越多。高龄妇女卵巢储备功能减退(decreasing ovarian reservation,DOR)[1]，在IVF-ET治疗过程中容易发生卵巢低反应(poor ovarian response,POR)。对于高龄DOR者，如使用常规的促排卵方案，其所需的促性腺激素(gonadotropin,Gn)量大，获得的卵子数目少，雌激素水平低，卵子质量下降，往往导致不良的妊娠结局。因此，多数生殖医学中心对于高龄DOR者常采用温和刺激方案或者微刺激方案，并尝试使用多种预处理，如生长激素(growh hormone，GH)、辅酶Q10、脱氢表雄酮、雌激素、地屈孕酮等，以期增加获卵数目，改善卵子质量，提高临床妊娠率[2-3]。但迄今为止，卵巢功能减退者的管理极具争议性，没有一种治疗方案在这一人群中被证明是最优的。本研究通过回顾性总结我院高龄DOR者IVF周期中使用GH的微刺激方案，探讨GH在高龄DOR者微刺激方案促排卵中的应用价值。
1 资 料 与 方 法
1.1 一般资料 收集2017年1月—2018年8月在石家庄市第四医院生殖中心接受IVF-ET治疗的高龄POR者180例，POR诊断符合2011年欧洲人类生殖与胚胎学学会提出的博洛尼亚标准[4]，入选标准包括：①年龄≥40岁；②基础血清促卵泡激素(follicle-stimulating hormone,FSH)≥10.0 U/L；③双卵巢基础窦卵泡数(antral follicle count,AFC)<5个；④抗苗勒管激素(anti-mullerian hormone,AMH)水平<1.1 μg/L。以上条件均需符合。排除标准：卵巢肿瘤、子宫内膜病变、生殖器畸形、内分泌疾病、重度子宫内膜异位症、男方严重少弱精等因素。根据其用药不同分为研究组和对照组各90例，2组平均年龄、不孕年限、体重指数(body mass index,BMI)、AFC、AMH、基础血清黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、GH、雌二醇(estradiol，E2)差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。
表1 2组一般情况比较
Table 1 Comparison of general data between two groups 
组别年龄(岁)不孕年限(年)BMI 基础窦卵泡数基础(个)FSH(U/L)基础LH(U/L) 基础E2(ng/L)AMH(μg/L)研究组42.62±2.556.68±5.2723.65±3.395.82±4.9813.26±2.683.76±2.8836.23±21.680.56±0.42对照组42.34±2.626.46±4.7822.78±3.566.10±5.3212.58±2.393.62±2.7941.30±21.060.59±0.42 t值1.2871.1081.5320.2361.3521.253 0.5540.463P值0.2010.2710.1730.8240.1870.209 0.6780.717
1.2 方法 2组均采用微刺激促排卵方案：于月经第2～4天起开始口服枸橼酸氯米芬(高特制药,50 mg/片)50 mg/d，月经第7～8天起每日肌内注射人绝经期促性腺激素(珠海丽珠医药，75 U/支)150～300 U，同时行阴道超声监测卵泡发育情况，并严密监测LH、E2、孕酮水平，当有1个卵泡平均直径≥20 mm或2个卵泡平均直径≥18 mm时，当晚皮下注射重组人绒毛膜促性腺激素[human chorionic gonadotropin(HCG)，艾泽，默克雪兰诺公司，250 μg/支]250 μg，于34～36 h后经阴道超声引导下行取卵术。研究组于月经第2，3天Gn启动时同时使用GH(赛增，长春金赛药业公司，4.5 U/支)4.5 U/d直至HCG日。取卵后如内膜较薄，于取卵当天开始给予戊酸雌二醇 (补佳乐，德国拜耳，1 mg/片)。并根据内膜的厚度调整雌激素剂量：子宫内膜厚度<4 mm，给予戊酸雌二醇10～12 mg/d；子宫内膜厚度4～6 mm，给予补佳乐8 mg/d；子宫内膜厚度>6 mm，给予补佳乐6 mg/d。移植日如内膜厚度≥7 mm，进行鲜胚移植；否则，则取消移植，冷冻胚胎。体外受精培养72 h后，选择可移植胚胎1～2枚进行移植，常规黄体支持。移植14 d、18 d测血HCG以明确是否妊娠，如妊娠，在移植后4～5周行阴道超声检查了解宫腔内孕囊个数及原始心管搏动情况，可见原始心管搏动者确定为临床妊娠。
1.3 受精及体外培养 根据高龄DOR者病史及男方精液情况选择IVF或单精子卵细胞浆内注射技术受精方式，受精后第3天观察卵裂情况，根据Veeck的卵裂期胚胎的形态学分级标准，结合胚胎卵裂球均1度和碎片将胚胎质量分为4级：1级胚胎，胚胎卵裂球大小均匀，形状规则，细胞质均匀清晰，碎片<5%；2级胚胎，胚胎的卵裂球均匀或大致均匀，细胞质均一，碎片5%～20%；3级胚胎，胚胎的卵裂球大小不均匀，细胞形态不规则，碎片>20%～50%；4级胚胎，胚胎的卵裂球大小及不均匀，细胞质有大量空泡，碎片>50%。 1～2级为优质胚胎，1～3级为可移植胚胎。
1.4 观察指标及判定标准
1.4.1 2组基础情况 年龄、不孕年限、BMI、AFC、AMH及基础FSH、LH、E2水平。
1.4.2 临床各项指标 控制性超排卵过程中Gn天数及Gn用量、HCG注射日雌激素水平及子宫内膜厚度。
1.4.3 实验室观察指标 获卵数、受精率(受精率=2PN受精数/获卵数×100%)、卵裂率(卵裂率=卵裂数/受精卵总数×100%)、优质胚胎率[(1级+2级胚胎数)/2PN胚胎数×100%]、移植胚胎数。
1.4.4 临床妊娠结局 临床妊娠率(临床妊娠周期数/总移植周期数×100%)及取消周期率[(因卵泡生长不良而未取卵+取卵而未获得卵子+无可利用胚胎)/治疗周期数×100%]。
1.5 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件分析数据。计量资料比较采用两独立样本的t检验；计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
3 结 果
2.1 2组超促排卵过程比较 2组在Gn总量、Gn天数、HCG日、E2水平、HCG日子宫内膜厚度差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。
表2 2组超促排卵过程比较
Table 2 Comparison of superovulation process between two groups
组别Gn总量(U)Gn天数(d)HCG日E2水平(ng/L)HCG日子宫内膜厚度(mm)研究组2 985.45±646.3211.02±3.531 145.36±72.489.86±2.68对照组2 826.82±598.9611.18±3.261 053.35±76.689.64±2.35 t值0.8541.6381.3221.725P值0.5170.1630.1890.144
2.2 实验室指标及临床结局比较 研究组有36例未移植者，其中17例为未获得卵子，5例为未受精，3例未卵裂，8例为内膜薄,3例为孕酮升高；对照组有40例未移植者，其中20例为未获得卵子，6例为未受精，3例未卵裂，3例为孕酮升高，8例为内膜薄。
研究组获卵数、优胚数、受精率、卵裂率明显多于或高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)；2组临床妊娠率、移植数及周期取消率差异均无统计学意义(P>0.05)。见表3。
表3 2组实验室指标及临床结局比较
Table 3 Comparison of laboratory indicators and clinical outcomes between two groups (n=90)
组别获卵数(x-±s,个)优胚数(x-±s,个) 移植数(x-±s,个)2PN受精(受精数/获卵数,%)2PN卵裂(卵裂数/受精数,%)取消周期(例数,%)临床妊娠(例数,%)研究组4.75±2.623.28±1.961.21±0.64287/347(82.71)268/287(93.38)25/90(27.78)17/54(31.48)对照组3.34±2.252.05±1.321.15±0.58176/234(75.21)154/176(87.50)29/90(32.22)14/50(28.00)t/χ2值2.1132.4580.7274.8514.6730.4230.150P值0.0220.0230.5830.0380.0310.5150.698
3 讨 论
随着年龄的增长，女性的生育能力逐渐下降。生育力下降的主要原因是卵巢储备功能减退、卵巢产生卵子能力减弱、卵母细胞质量下降、胚胎非整倍体率增加、受孕率低、流产率升高。其次，随着年龄的增加，妇女盆腔炎症、生殖器肿瘤、子宫内膜异位症等疾病的发病率升高，也会导致生育能力下降。2016年美国疾病控制与预防中心统计数据显示，卵巢储备功能减退妇女占助孕人群的30%左右[5]。目前，对于高龄生育年龄的界定仍然存在争议，比较公认的是以35岁为界，年龄>35岁尤其是>40岁之后，卵巢功能更是呈直线下降[6]。美国妇产科协会专家2015年共识提出，年龄>40岁的女性因生育力已接近衰竭阶段，推荐直接行IVF-ET助孕[7]。但是高龄女性，卵巢内卵泡数目减少，分泌雌激素减少，对垂体的负反馈作用减弱，黄体期FSH提前升高，升高的FSH可使FSH受体数量下降，导致卵巢对促性腺激素反应性下降[3]。对于高龄者，尤其是40岁以上高龄者，我中心多采用微刺激方案，与长方案相比，微刺激方案虽然获卵数和获胚胎数较少，但该方案对卵巢刺激小，Gn用量少，发生卵巢过度刺激综合征等的风险低。
GH是由脑垂体前叶分泌的一种促进机体组织代谢的蛋白质激素，它是腺垂体中含量最多的激素。GH的分泌主要受下丘脑生长激素释放激素和生长抑素的双重调节，GH的基础分泌呈节律性脉冲式释放，脉冲的周期与年龄、性别相关，通常儿童高于成年人，女性稍高于男性。血清中的GH还受睡眠、活动、血糖及性激素水平等多种因素的影响。入睡后GH分泌量明显增加，约60 min达高峰，以后逐渐降低。在人的一生中，青春期GH分泌率最高，随着年龄增长而逐渐减少，50岁后睡眠期的GH峰逐渐消失，至60岁时仅为青年时的50%。近年来，GH在生殖领域的作用也越来越被人们所发现。基于GH在不同年龄段的分泌规律，有学者对年龄>35岁及<35岁者分别使用GH，发现对于年龄>35岁的高龄DOR者，使用GH可增加获卵数及HCG日雌激素水平，减少促性腺激素的使用量，而对于年龄<35岁DOR者的卵巢反应性及IVF治疗结局无影响[8]。郭莹等[9]研究也表明，对年龄≥35岁的DOR者，添加GH可以减少促性腺激素使用量，提高HCG日E2水平及获卵数；而对于年龄<35岁者，添加GH对于卵巢反应性及IVF结局均无显著改善。李梅清等[10]研究发现，在年龄>35岁高龄DOR者黄体期促排卵方案中添加GH，可以明显降低Gn的使用总量以及使用时间，增加子宫内膜厚度，提高临床妊娠率及累计妊娠率。Du等[11]也得出相似的结论。本研究所设目标人群为年龄≥40岁的高龄卵巢功能下降者，添加GH可以增加周期获卵数、受精数及优胚数，且在妊娠率方面也有所提高。
POR是在IVF促排卵治疗过程中出现的一种特殊情况，主要表现为卵巢对Gn刺激反应不良、发育的卵泡少、血雌激素峰值低、Gn用量多、周期取消率高、获卵数少和临床妊娠率低[1]。卵巢对促排卵治疗反应低下是卵巢功能减退的标志。多项研究表明，在促排卵过程中应用GH对卵巢进行处理,可以提高卵巢对促排卵药物的敏感性，从而增加卵子数量和提高卵子质量[12-15]。随着对生殖生理研究的深入，发现GH对人类生殖系统发挥着强大的作用。GH可以通过多种方式提高卵巢对促性腺激素的反应性。GH的部分效应可通过诱导肝细胞等外周靶细胞产生胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor,IGF)而实现，其中IGF-1是卵巢功能的重要调节因子之一，是GH发挥作用的调节介质。IGF-1能激活卵巢功能，协同促性腺激素调节卵泡的生长发育与激素的合成。GH可以增加黄体生成素受体水平，促进卵泡颗粒细胞产生血管内皮生长因子，从而提高卵巢对超排卵的反应性。Yovich等[16]研究证实，GH在窦前卵泡的生长和分化中起着重要的作用，并且由于卵母细胞上的IGF-1受体，GH也可能通过刺激IGF-1的分泌促进次级卵母细胞的发育。此外，GH还刺激小的窦卵泡发育到依赖促性腺激素的阶段。这些数据均表明GH可以增加卵巢的反应性，增加获卵数目。本研究结果显示，使用GH组的获卵数平均为(4.75±2.62)个，未使用GH组的获卵数平均为(3.34±2.25)个，使用GH组的获卵数明显多于未使用GH组(P<0.05)。
另有学者研究认为，GH改善IVF的结局归因于GH提高了卵子和胚胎的质量以及改善子宫内膜对胚胎的容受性[17]。GH作用于人类卵母细胞的具体机制目前尚不明确，Weall等[18]研究证明人类卵母细胞膜周有GH受体表达，GH可直接作用于卵母细胞，上调自身受体，增加线粒体活性。随着年龄的增长，GH受体在卵母细胞的表达下降，有功能的线粒体也下降，致使卵泡发育受阻，染色体分离紊乱，导致受精失败。在高龄妇女中使用GH，可以上调GH受体，提高线粒体功能，从而起到改善卵母细胞质量的作用。田莉等[13]对前一周期因胚胎质量不佳或无可移植胚胎而失败者进行低剂量GH预处理，结果发现经过GH预处理后，其受精率、优胚率及临床妊娠率均显著提高。最近的一项荟萃分析显示,在Gn过程中加用GH可有效改善IVF-ET的临床妊娠率和活产率[19]。Keane等[20]回顾性研究发现，在IVF周期添加GH可以提高胚胎种植率、临床妊娠率及活产率。本研究使用GH治疗者比未接受GH治疗者具有更高质量的胚胎，临床妊娠率也有所提高，进一步证实GH可能通过改善胚胎质量提高植入率和临床妊娠率。研究表明GH可通过增加雌激素的分泌，进而促进子宫内膜的发育；GH可直接促进内皮细胞有丝分裂加速细胞增殖，促进蛋白质代谢改善子宫内膜的容受性；GH还可增加子宫内膜局部血流灌注，调控多种生物活性因子，从而改善子宫内膜的容受性[21-23]。本研究对高龄DOR者实施微刺激促排卵，添加GH与不添加GH，2组子宫内膜厚度没有明显变化，可能与在微刺激促排卵中使用氯米芬(氯米芬具有抗雌激素的作用，影响子宫内膜的发育，抑制了子宫内膜的生长)有关。
本研究结果显示，在高龄DOR者微刺激促排卵方案中添加GH是获益的，添加GH可以增加高龄者获卵数、受精数及优质胚胎数，在妊娠率方面也有所提高。其与相关研究结果[24-26]一起提供了进一步的科学证据，支持使用外源性GH进行POR的临床管理。GH使用时间延长，可能会更有效改善POR患者的妊娠结局[27]。未来需要更大样本的临床试验以进一步明确GH在高龄者中给药的时间、最佳剂量、对其后代的安全性和具体的作用机制。
[1] 武学清,孔蕊,田莉,等.卵巢低反应专家共识[J].生殖与避孕,2015,35(2):71-79.
[2] 石玉华，李敬.高龄女性助孕措施选择[J].山东大学学报：医学版，2017,55(1)：22-25.
[3] 张翠莲.高龄女性二胎生育力评估及助孕策略[J].中华实用诊断与治疗杂志,2016,30(12):1145-1148.
[4] Ferraretti AP,La Marca A,Fauser BC,et al. ESHRE consensus on the definition of ‘poor response’ to ovarian stimulation for in vitro fertilization:the Bologna criteria[J]. Hum Reprod,2011,26(7):1616-1624.
[5] European Society for Human Reproduction and Embryology (ESHRE) Guideline Group on POI，Webber L，Davies M， et al. ESHRE Guidellne： management of women with premature ovarian insufficiency[J]. Hum Reprod，2016，31(5)：926-937.
[6] 中国医师协会生殖医学专业委员会.高龄女性不孕诊治指南[J].中华生殖与避孕杂志，2017，37(2)：87-100.
[7] 乔杰,马彩虹,刘嘉茵,等.辅助生殖促排卵药物治疗专家共识[J].生殖与避孕,2015,35(4):211-223.
[8] 宋慧玲，郭艺红，孙莹璞，等.生长激素对不同年龄卵巢储备功能趋于低下患者IVF-ET治疗结局的影响[J].生殖与避孕，2013,33(1):58-62.
[9] 郭莹,杨娜,蒋向荣,等.IVF-ET中不同年龄卵巢储备功能减退女性应用生长激素的效果分析[J].中国计划生育学杂志，2017,25(11):760-763.
[10] 李梅清,廖宏庆，肖江华，等.黄体期使用生长激素在高龄卵巢储备功能减退患者中的临床应用[J].中华生殖与避孕杂志，2017,37(6):450-452.
[11] Du XF,Yang XH,Li J,et al. Growth hormone co-treatment within a GnRH agonist long protocol improves implantation and pregnancy rates in patients undergoing IVF-ET[J]. Arch Gynecol Obstet,2016,294:877-883.
[12] 王雪梅，刘迎春，黄静，等.生长激素在卵巢储备功能低下患者IVF-ET中的应用[J].生殖医学杂志,2019,28(1):41-44.
[13] 田莉,马淳,周寒鹰,等.重组生长激素应用于IVF前次失败患者的初步探讨[J].生殖医学杂志,2017,26(5):438-441.
[14] 文壹,毛增辉，唐君，等.生长激素在高龄女性微刺激方案助孕中的运用研究[J].医学与哲学，2017,38(18):25-27.
[15] 刘志华,王园.重组人生长激素超促排卵对卵巢反应不良患者的影响分析[J].中国实用医药，2017,12(31):95-97.
[16] Yovich JL,Stanger JD. Growth hormone supplementation improves implantation and pregnancy productivity rates for poor-prognosis patients undertaking IVF[J]. Reprod Biomed Online,2010,21(1):37-49.
[17] Ho YK,Lee TH,Lee CI,et al. Effects of growth hormone plus gonadotropins on controlled ovarian stimulation in infertile women of advanced age,poor responders,and previous in vitro fertilization failure patients[J]. Taiwan J Obstet Gynecol,2017,56(6):806-810.
[18] Weall BM,Al-Samerria S,Conceicao J,et al. A direct action for GH in improvement of oocyte quality in poor-responder patients[J]. Reproduction,2015,149(2):147-154.
[19] Li XL,Wang L,Lv F,et al. The influence of different growth hormone addition protocols to poor ovarian responders on clinical outcomes in controlled ovary stimulation cycles:a systematic review and meta-analysis[J]. Medicine(Baltimore),2017,96(12):e6443.
[20] Keane KN,Yovich JL,Hamidi A,et al. Single-centre retrospective analysis of growth hormone supplementation in IVF patients classified as poor-prognosis[J].BMJ Open,2017,7(10):e018107.
[21] 吴晓燕，谭展虹，刘蓓媚,等.POR患者采用拮抗剂方案加用GH对子宫内膜容受性及妊娠结局的影响[J].中国性科学,2018,27(8):79-83.
[22] 梅德华.生长激素联合17β-雌二醇治疗薄型子宫内膜63例临床评价[J].中国药业,2018,27(2):63-65.
[23] 禹虹，唐慧珍，柳朝华，等.生长激素宫腔灌注在薄型子宫内膜冻融胚胎移植中的疗效观察[J].中国医师杂志,2017,19(3):371-375.
[24] Bayoumi YA,Dakhly DM,Bassiouny YA,et al. Addition of growth hormone to the microflare stimulation protocol among women with poor ovarian response[J]. Int J Gynaecol Obstet,2015,131(3):305-308.
[25] 吴洪波,李柳铭,李慕军,等.IVF-ET中卵巢低反应患者拮抗剂方案中应用生长激素的研究[J].生殖与避孕,2016,36(5):416-420.
[26] 周晓景,王芳，戚静宜，等.生长激素改善卵巢储备功能减退患者中体外受精结局的自身对照研究[J].首都食品与医药,2018,25(12):27-28.
[27] 朱芳芳,马瑞红，胡琮琦，等.生长激素应用于卵巢低反应患者的不同添加方案[J].生殖医学杂志,2018,27(7):697-701.