随着全球经济的快速发展，大家对外貌的美观性等的要求与日俱增，表现在口腔临床领域,特别以口腔美容要求的增高显得特别突出。错颌畸形是现代口腔颌面部的常见疾病，以青少年多见，此疾病既影响人体容貌、妨碍发音，也可导致消化不良等消化系统疾病，严重者甚至造成患者出现心理障碍和精神障碍，需要进行正畸治疗[1-3]。牙周病的重要致病菌之一是牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)，其分泌牙龈蛋白酶、呵嗦等代谢产物，对牙周组织具有较大的破坏作用[4-6]。有研究表明，牙龈卟啉单胞菌在炎症明显部位存在较多，而在健康牙龈内较少出现，与牙周炎治疗后反复发作密切相关，正畸治疗可促进牙龈卟啉单胞菌及牙龈蛋白K的增加，但对牙龈蛋白R(gingival protein R，Rgp)的报道少见[7-8]。基于此,本研究拟通过16S rDNA、PCR技术分别检测受试对象使用固定矫治器之前以及经固定矫治器之后不同时间点(1，2，3，6个月)的龈沟液,并对检测中收集到的P.g及Rgp水平进行比较，探讨正畸治疗对Rgp变化的影响及引发牙龈炎症的风险，旨在为治疗牙龈炎症及防止牙周组织发生不可逆性损伤提供参考依据。
1 资 料 与 方 法
1.1 一般资料 随机抽取2017年4月—2018年7月在湖北省武汉市红十字会医院进行正畸治疗的12～18岁青少年患者118例，其中男性50例，女性68例。所有患者在进行正畸治疗前7 d进行口腔卫生健康教育，以保证其均会使用Bass刷牙法。治疗矫正方式统一选用直丝弓矫治技术，并且分别于矫治前及矫治器戴入后的4个不同时间点(1，2，3，6 个月)收集取龈沟液，-20 ℃保存备用。纳入标准：确诊需要进行正畸矫正的患者；正畸治疗前无龋齿龋洞，无牙周及黏膜疾病的正畸患者；能够配合研究始终的受试对象。排除标准：近3个月内服用激素、抗生素以及由此引发牙龈增生的患者；因各种原因不能配合研究始终的患者；病历资料不完整的受试对象。
1.2 主要实验菌株、仪器、试剂 P.g标准菌株ATCC33277，Fn标准菌株ATCC25586，Aa标准菌株 ATCC29522(四川大学华西口腔医学院)及P.g W83菌株(华西口腔医学研究中心)；细菌基因组提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)；EasyTaq PCR SuperMix PCR 试剂盒(北京天根生化技术有限公司)；引物合成由上海博尚生物技术有限公司合作提供；电泳槽、梯度PCP仪(T-Gradient The-moblockBiometra)；Gel-Doc2000 凝胶成像和分析系统(美国 Bio-Rad公司)；PAC-300型电泳仪制胶器等。
1.3 牙龈指数[4]测定 0级提示牙龈处于正常状体；Ⅰ级提示轻度炎症状态，临床可见牙龈有轻度颜色改变并伴有轻度水肿，但探诊不出血；Ⅱ级为中度炎症状态，检查可见患者出现牙龈水肿光亮、颜色发红的表现，探诊有出血；Ⅲ级为重度炎症，典型表现包括牙龈出现明显的水肿、发红、溃疡表现以及自发出血倾向。
1.4 细菌检测
1.4.1 标本采集 经无菌纸尖法[5]在不同时间点进行龈沟液标本的采集工作，采集由同1位检查者完成，并保证使用相同的操作。具体采集流程：首先于样本采集前嘱受试对象使用0.9%NaCl溶液清洁口腔，然后使用棉卷隔离取样牙，统一取右上侧切牙和中切牙进行龈沟液采集，吹干牙面后将无菌纸尖插入龈沟，停留10～30 s取出，预先准备好含有无菌生理盐水的EP试管，将采集标本后的无菌纸放入EP试管，-20 ℃保存备用。
1.4.2 标本DNA提取 溶解标本,离心2 min后提取DNA。离心12 000 r/min，最大离心半径6 cm；弃上清后收集沉淀,沉淀中加入裂解缓冲液200 μL，充分混匀后进行100 ℃水浴，水浴10 min，再次离心，离心2 min；取上清作为模板(150 μL)并且保存于-20 ℃条件下准备进行PCR试验。
1.4.3 PCR扩增反应 对DNA提取样本进行PCR扩增反应。使用的P.g 16S rDNA片段大小为404 bp，退火温度为57 ℃，引物序列(5′～3′) P.g F:AGGCAGCTTGCCATACTGCG；P.g R:ACTGT-TAGCAACTACCGATGT。Rgp-cd片段大小为870 bp，退火温度为58 ℃，引物序列(5′～3′)Rgp-cd F:GAACTGAGGACCATCATTG；Rgp-cd R:GCTGGCATTAGGAACACCTG。PCR扩增反应中，首先取buffer液(2.5 μL)(10×Trans Start Taq Buffer)，同时与引物各1.0 μL充分混合，然后同时取Trans Start Taq DNA Polymerase 0.5 μL及dNTPs 2 μL，使用无菌双蒸水补充至总体积25 μL，以模板DNA 10 μL进行反应。PCR反应P.g循环条件具体为：第一步进行预变性，在94 ℃下进行，预变性时间 5 min；第二步完成变形，在4 ℃完成，变性时间30 s；第三步为退火，57 ℃下退火30 s；第四步为延伸，在进行72 ℃下延伸1 min(33个循环)。循环后继续进行72 ℃延伸10 min；最后4 ℃保存。其中Rgp循环条件细则：首先94 ℃预变性5 min；相同温度下变性30 s；随后58 ℃退火30 s；在完成33个循环的72 ℃延伸(1 min)后继续72 ℃延伸10 min；最后4 ℃保存。
1.4.4 PCR检测 以16S rDNA为引物，标准菌株DNA为模板进行PCR检测，其中阳性对照选取P.g W83菌株和P.g ATCC33277完成，阴性对照选取Fn ATCC25586完成，空白对照则为无菌双蒸水。检测反应体系的敏感性和引物的特异性后以16S rDNA为引物，以临床标本DNA为模板进行检测，确定P.g阳性患者并且在P.g阳性患者中进一步检测Rgp。
1.4.5 凝胶电泳检测 PCR 扩增产物：取PCR扩增产物以及染液，避光完成染色；然后使用琼脂糖凝胶进行水平电泳；电泳中使用Ladder DNA Marker 完成产物相对分子质量的确定工作，电泳凝胶溴化乙啶中染色后自动凝胶成像分析仪拍照存图。
1.5 统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件处理数据。计数资料比较采用χ2检验；相关性采用Spearman等级相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 16S rDNA PCR 技术的敏感性及特异性情况 通过凝胶电泳方式进行测定，结果提示菌株ATCC33277及菌株W83在DNA扩增后均可见清晰的404 bp出现特异性扩增带，以及870 bp的特异性扩增带；与此同时，阴性对照可见Fn ATCC25586、Aa ATCC29522没有扩增带，空白对照也未见扩增带。
2.2 16S rDNA PCR 检测结果
2.2.1 P.g检测 PCR扩增物检测结果可见临床标本 2，6，8，10及阳性对照标本，均可见404 bp特异性扩增条带，而与此同时空白对照、阴性对照以及临床标本 4，5，7，9均未见目的条带。
2.2.2 Rgp检测 PCR扩增物检测结果显示，临床标本 3，5，6和阳性对照可见870特异性扩增条带，而阴性对照、空白对照及临床标本2，4，7，8，9未见目的条带。
2.2.3 P.g、Rgp检出率 与矫正前比较，矫正后1，2个月P.g检出率逐渐升高，矫正后3个月开始下降(P<0.05)；与矫正前比较，矫正后2，3个月Rgp检出率呈升高趋势(P<0.05)。见表1，2。
表1 118例患者矫正后1，2，3，6个月与矫正前P.g检出率比较
Table 1 Comparison of P.g detection rate between 1, 2, 3, 6 months after correction and before correction in 118 patients (例数，%)
检测时间P.g检出情况矫正前 35(29.66) 矫正后1个月63(53.39)∗矫正后2个月85(72.03)∗矫正后3个月71(60.17)∗矫正后6个月45(38.14) χ2值54.410P值0.000
*P值<0.05与矫正前比较(χ2检验)
表2 矫正后1，2，3，6个月与矫正前P.g检出阳性中Rgp检出率比较
Table 2 Comparison of Rgp positive rate in P.g positive 1, 2, 3, 6 months after correction and before correction (例数，%)
检测时间例数P.g检出阳性中Rgp检出情况矫正前 3512(34.29) 矫正后1个月6334(53.97) 矫正后2个月8559(69.41)∗矫正后3个月7448(67.61)∗矫正后6个月4519(42.22) χ2值20.243P值0.000
*P值<0.05与矫正前比较(χ2检验)
2.2.4 牙龈指数与P.g、Rgp检出率关系 牙龈指数与P.g、Rgp检出阳性率之间均存在正相关(rs=0.352、0.461，P<0.05)。
3 讨 论
P.g分泌、合成牙龈蛋白，是一种毒力因子，能够降解机体的生理蛋白，降低机体免疫力，与牙龈炎的形成密切相关[7]。在进行正畸治疗过程中，矫治器可破坏口腔内内环境稳态，牙菌斑增多，正常菌群变成致病菌，导致牙龈炎的发生[9-15]。
本研究结果显示，在118例患者中，矫正前和矫正后1，2，3，6个月P.g检出阳性率依次为29.66%、53.39%、72.03%、60.17%、38.14%，与矫正前比较，矫正后1，2个月P.g检出阳性率逐渐升高，矫正后3个月开始下降，到矫正后6个月时P.g检出阳性率略高于矫正前。表明矫正器对口腔内环境有一定的破坏作用，能够改变口腔内微生物生态平衡，尤其是在矫正后的3个月内，到第6个月才开始逐渐恢复。这可能是由于矫治器在口腔内，不利于人们清除牙齿间的牙菌斑，导致口腔内微环境失衡，牙龈组织发炎[16]。相关研究也表明，在矫正早期P.g检出阳性率较高，到第6个月时P.g检出阳性率已接近矫正前[17]。本研究结果还显示矫正前和矫正后1，2，3，6个月P.g检出阳性中Rgp检出阳性率依次为34.29%、53.97%、69.41%、67.61%、42.22%，与矫正前比，矫正后2，3个月Rgp检出阳性率呈升高趋势，到矫正后6个月时只略高于矫正前。这可能是由于患者在戴矫治器初期口腔内环境紊乱，再加上患者对口腔卫生的重要性还未引起足够的重视[18-19]，导致口腔内微生物、细菌繁殖增多，在戴矫正器2个月后，患者开始适应，并注意维持清洁的口腔卫生，口腔内细菌繁殖减少，3个月后牙龈炎症开始得到控制，到第6个月时牙龈炎症明显缓减。本研究Spearman等级相关分析显示，牙龈指数与P.g、Rgp检出阳性率之间均存在正相关(rs=0.352、0.461，P<0.05)。表明Rgp与牙龈炎发生密切相关的毒力因子，可为细菌生长和毒力发挥提供营养，降低宿主的免疫力，破坏口腔牙周组织细胞，造成牙龈水肿，损害牙龈健康[20]。因此，临床正畸治疗工作中开展牙龈沟液内Rgp的检测，针对检测结果及时确定并实施合理的口腔正畸治疗及口腔护理方案，密切监测Rgp的变化，对正畸治疗过程中早期及时预防牙龈炎性反应发生和防止不可逆性牙周组织损害是十分关键的。
综上所述，在进行正畸治疗过程中，保持口腔卫生非常重要，患者应当纠正不良的口腔卫生习惯，维持良好的口腔卫生，做好口腔卫生防护工作，在餐后及每次吃完食物后均应进行刷牙、漱口，以减少口腔内细菌滋生，预防和控制牙龈炎的发生。
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