LC-MS/MS法测定癫痫患者血浆中扑米酮的浓度

癫痫是由多种病因导致的一种慢性脑部疾病，其表现形式多样，病因复杂，易反复发作[1-3]。扑米酮是第一代抗癫痫药物，口服给药后吸收迅速且完全。该药用于癫痫强直阵挛性发作(大发作)、单纯部分性发作和复杂部分性发作的单药或联合用药治疗，也用于特发性震颤和老年性震颤的治疗。扑米酮药动学个体间差异大、治疗窗窄，可引起嗜睡、共济失调等不良反应，有时会发生巨幼细胞性贫血、白细胞减少和血小板减少，故有必要对其进行临床血药浓度监测。目前，常用的测定扑米酮血药浓度的方法主要有高效液相色谱法[4]，该方法敏感度低，样品前处理时间长且干扰性因素多。本研究旨在建立一种方便高效、敏感度高的测定扑米酮含量的高效液相色谱串联质谱(high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)方法，并用于测定癫痫患者的血药浓度，以便为临床血药浓度监测及药代动力学研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品扑米酮(批号：100331-201002；纯度：99.7%)和咖啡因(批号：171215-2010；纯度：99.9%)均购自中国食品药品检定研究院；甲醇为色谱纯；水为超纯水；其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器质谱仪：4000Q TRAP型质谱仪，配有ESI源(美国AB SCIEX 公司)；液相色谱仪：HPLC-30A液相色谱系统，配有液相输液泵、自动进样器、柱温箱(日本岛津公司)；数据系统：AnaLyst TF 1.6软件(美国AB SCIEX 公司)；D3024型台式高速微量离心机(美国赛洛捷克SCILOGEX公司)；MX-S型固定式混匀仪(大龙兴创实验仪器有限公司)。

1.3 受试者选择本研究方案已由河北医科大学第一医院伦理委员会审核并批准，受试者均签署知情同意书。所选20例受试者均为癫痫患者，男性13例，女性7例，年龄20～45岁，中位年龄31.8岁，身高162～180 cm，体重53～80 kg。

1.3.1 入选标准 ①根据各类癫痫相关诊断标准，确诊为癫痫患者；②最近2周内没有服用其他药物；③无其他重大身体问题或疾病。

1.3.2 排除标准 ①非癫痫所致精神障碍者；②伴有严重心、肝、肾等脏器功能障碍者；③伴有肿瘤、造血系统、甲状腺功能亢进等其他系统疾病者；④妊娠期或哺乳期妇女；⑤有吸毒史者；⑥属于易过敏体质，对扑米酮存在过敏反应者；⑦药物依从性差，无法坚持服用药物者；⑧病历资料不完整者。

1.4 治疗方案和血样本采集选取20例临床口服扑米酮片的癫痫患者(起始剂量为50 mg，1次/d；3 d后改为50 mg，2次/d；7 d后改为50 mg，3次/d； 10 d后改为250 mg，3次/d)，于2周后清晨取静脉血2 mL。置于离心管(肝素钠抗凝)中，于4 ℃下以4 000 r/min离心5 min，取血浆，置于-20 ℃冰箱中保存待用。

1.5 色谱条件色谱柱：Phenomenex Kinetex XB-C18(50 mm×3 mm，2.6 μm)；流动相：甲醇(A)-2%甲酸水(B)梯度洗脱，0～1.5 min、30% A→80% A，1.5～2.8 min、80% A，2.8～3.5 min、80%A→30%A；流量：0.4 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：5 μL。

1.6 质谱条件离子源为电喷雾离子化源，用多反应监测模式进行定量分析，用正离子检测模式。源喷射电压为5 500 V；离子源温度为600 ℃；雾化气(GS1，N2)压力为379.22 kPa；辅助气(GS2，N2)压力为379.22 kPa；气帘气(N2)压力为137.90 kPa。接口加热，全程通入氮气，多反应监测模式定量。扑米酮和内标的去簇电压分别为67.95 V、88.88 V，碰撞能量分别为17.02 V、31.35 V。扑米酮和内标的离子反应对分别为m/z 219.3→162.2、m/z 195.1→110.2。

1.7 血浆样品处理精密量取血浆100 μL，置于离心管中，加入内标溶液10 μL，甲醇20 μL涡旋混匀30 s，加入甲醇270 μL，涡旋混匀60 s，在4 ℃下离心10 min(1.50 × 104 r/min)，取上清液，经0.22 μm滤膜过滤后进样分析。

1.8 溶液的配制扑米酮对照品溶液：精密称取扑米酮对照品1 mg，用甲醇溶解后定容于1 mL 量瓶中，即得扑米酮的对照品储备液1 g/L；于4 ℃冰箱保存备用。临用时用甲醇稀释成相应浓度10，50，100，200，300，400，500 mg/L的对照品工作液。

内标溶液：精密称定内标物咖啡因对照品1 mg，置于1 mL容量瓶中，加1 mL甲醇使溶解，配制成质量浓度为1 g/L的内标工作液；取内标工作液适量，用甲醇稀释，配成质量浓度为1 mg/L的咖啡因内标溶液，置于4 ℃保存备用。

1.9.1 专属性根据上述色谱条件及样品处理方法测得：①空白血浆+内标对照品；②空白血浆+内标对照品+扑米酮对照品；③患者用药后血浆+内标对照品。

1.9.2 标准曲线和定量下限取空白血浆100 μL、相应质量浓度扑米酮和内标对照品工作液各10 μL，甲醇10 μL，配制成血浆中扑米酮浓度为1，5，10，20，30，40，50 mg/L的血浆样品，按“1.7”项下自“涡旋30 s”的方法进行处理，在本实验条件下进样分析。以扑米酮与内标质量浓度的比值为横坐标轴(X)，以扑米酮与内标峰面积的比值为纵坐标轴(Y)，绘制标准曲线。利用加权最小二乘法计算线性回归方程，权重系数为1/X2。

1.9.3 精密度与回收率取100 μL空白血浆分别加入内标溶液和一定浓度的扑米酮溶液各10 μL，甲醇10 μL，制备低、中、高3种浓度的扑米酮(5，20，40 mg/L)的质控样品各6份，按“1.7”项下自“涡旋30 s”的方法进行处理，在本实验条件下，同日进行进样分析，测得日内精密度；连续测3 d，测得日间精密度。取上述低、中、高浓度质控样品各6份，按“1.7”项下自“涡旋30 s”的方法处理，进样分析，作为提取后样品。同时，另取5份空白样品100 μL，加入甲醇270 μL，涡旋60 s，于4 ℃下离心10 min(1.50×104 r/min)，取上清液，加入相应浓度的扑米酮、内标溶液和甲醇，作为未提取样品。提取后样品峰面积与未提取样品峰面积比值计算提取回收率。

1.9.4 稳定性分别配制低、中、高含扑米酮(5，20，40 μg/L)5个浓度的血浆样本，考察在室温下放置12 h，经过冷冻-解冻3次，-20 ℃放置1周和4周后分别进行浓度测定。

1.9.5 基质效应取上述质控样品各6份，进样分析，得相应峰面积；用纯水代替血浆，加入内标溶液和不同浓度的扑米酮对照品溶液适量，配成扑米酮质量浓度分别为5，20，40 mg/L的质控样品溶液各6份，按“1.7”项下自“涡旋30 s”同法操作，得相应峰面积，以每一浓度2种处理方法的峰面积比值计算百分比。

2 结果

2.1.1 专属性在该色谱条件下扑米酮和内标的色谱峰能完全分离，且无明显的杂质峰干扰。扑米酮和内标物的保留时间分别为2.20 min、1.19 min。此结果表明该实验方法具有较高的专属性,见图1，2。

2.1.2 标准曲线与定量下限得出扑米酮方程：Y=7.56×103X-4.66×104(r=0.998 7)。结果表明扑米酮在浓度范围分别为1～50 mg/L内具有良好的线性关系。定量下限为6 μg/L。

2.1.3 精密度与回收率日内、日间精密度的相对标准偏差均小于15%，提取回收率均在95%以上，见表1。

2.1.4 稳定性血浆中扑米酮在室温下放置12 h，经过冷冻-解冻3次，-20 ℃放置1周和4周后分别进行测定。结果显示，血浆样品在上述条件下均稳定，相对标准偏差值均小于15%。

2.1.5 基质效应扑米酮在上述3个质量浓度下，内标归一化的基质因子分别为91.46%、89.74%和104.91%(相对标准偏差<15%，n=6)；内标咖啡因的内标归一化的基质因子分别为92.67%(相对标准偏差<15%，n=6)。结果提示样品测定不受基质效应影响。

2.2 方法学应用 20例临床癫痫患者所测得的血药浓度范围为扑米酮8.75～36.88 mg/L，见表2。

3 讨论

目前对抗癫痫药物的浓度进行分析的方法有色谱法和免疫法[5-6]。本实验采用以咖啡因作为内标的LC-MS/MS法测定人血浆中扑米酮的浓度。在流动相的选择方面，通过查阅相关文献[7-9]，本实验决定选取几种不同构成的流动相进行比较，包括乙腈-水体系、甲醇-水体系、乙腈-酸水体系、甲醇-甲酸水体系，比较后发现，选用甲醇-甲酸水作为流动相时的药物分离度及峰形均很好，易于实验测定；在尝试了多种配比后，选择了以甲醇-2%甲酸水作为流动相，进行梯度洗脱，药物与内标的分离度最合适，峰形最好。

在血浆样品的处理方法上，本实验选用了蛋白沉淀法作为处理方法。本实验考察了甲醇和乙腈2种有机溶剂，结果乙腈的蛋白沉淀率与甲醇相差不多，但使用乙腈时会产生溶剂化效应，导致色谱峰加宽，从而影响色谱分离效果[10-11]。因此，本研究选择了甲醇作为蛋白沉淀剂，结果显示此方法可用于癫痫患者体内扑米酮的血药浓度分析，其专属性强、精密度好、准确度高，适用于临床研究中扑米酮的含量测定。

有报道称扑米酮的有效血药浓度范围为5～12 mg/L[12]。本研究20例癫痫患者测得扑米酮的血药浓度范围为8.75～36.88 mg/L，由此可知，20例癫痫患者服用扑米酮的剂量一致，但测得的血药浓度并非完全一致，存在一定的个体差异性，其中多数患者高于有效浓度。同时，大量研究表明，抗癫痫药物的血药浓度个体差异较大，治疗效果不同，不良反应多样[13-15]。因此，临床使用时，应通过血药浓度监测，制定个性化给药方案，这对癫痫患者控制病情、预防不良反应发生十分必要。

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LC-MS/MS法测定癫痫患者血浆中扑米酮的浓度

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

Determination of primidone in plasma of epileptic patients by LC-MS/MS

2 结果

3 讨论