·论 著·
辅助生殖技术中，一般受精率为70%～80%，有相当一部分卵母细胞不能受精，即受精失败[1-2]。虽然临床上可使用卵胞浆内单精子显微注射(intracytoplasmicsperminjection，ICSI)获得较高的受精率和卵裂率，但是ICSI受精失败仍时有发生，特别是当精子存在严重畸形(如圆头精子症等)时，ICSI的受精率很低。卵母细胞能否被激活是成功受精的关键[3]，故卵母细胞的激活方法及其激活机制越来越成为研究的热点。而对于ICSI受精失败的患者，通过ICSI联合辅助卵母细胞激活技术(assisted oocyteactivation，AOA)可以获得临床妊娠，并出生健康婴儿[4]。本研究回顾性分析我院生殖医学科进行ICSI联合AOA处理的助孕者的临床资料，旨在评价AOA在辅助生殖技术中的临床应用效果。
1.1 一般资料 选择2016年1月—2019年2月于我院生殖医学科行ICSI联合AOA受精者的临床资料。其中至少有1次ICSI完全受精失败，再次行ICSI助孕者8例(A组)，年龄26～37岁，平均(32.9±3.3)岁；精子严重畸形(如圆头精子症等)需行ICSI助孕者15例(B组)，年龄30～39岁，平均(33.1±2.9)岁。排除标准：可能导致前次ICSI受精失败的非激活障碍者，如卵母细胞本身质量差或畸形；获得成熟的卵母细胞数目过少(<3枚)者。
1.2 研究方法
1.2.1 卵母细胞的获取和授精 卵巢刺激方案采用黄体期长方案或拮抗剂方案，使用促性腺激素后，超声监测卵泡发育情况及血清黄体生成素、雌二醇水平，调整促性腺激素剂量。当卵泡发育达到至少有1个主导卵泡直径≥18 mm，或者2个主导卵泡直径≥17 mm，抑或3个卵泡直径≥16 mm时，当日晚给予人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，HCG)5 000～10 000 U进行扳机，36～38 h经阴道超声引导下取卵[5]。获得卵冠丘复合物，将其在体外继续培养2～3 h后，使用透明质酸酶溶液进行脱颗粒处理，去除颗粒细胞后的卵母细胞进行成熟程度的评估，并将成熟卵母细胞1h后行ICSI操作。
1.2.2 ICSI后卵母细胞的激活 在行ICSI后立即将卵母细胞置于预平衡好的含5 μmol/L钙离子载体A23187 (Sigma，美国)的受精液G-IVF(Vitrolife，瑞典)中，并置于37 ℃、6% CO2培养箱中孵育15 min，进行人工辅助激活。激活后的卵母细胞经预平衡的受精液清洗2遍后，移入预平衡的受精液中继续培养。
1.2.3 原核及卵裂的观察 卵母细胞激活处理后17～19 h，将卵母细胞移入预平衡的卵裂液G1(Vitrolife，瑞典)后，倒置显微镜下观察，并对原核(pronucleus，PN)数目等进行评估，2PN为正常受精。24 h及48 h观察胚胎发育情况，根据卵裂球数目、卵裂球大小是否均匀、细胞碎片多少等，进行卵裂期胚胎的评分。优质胚胎标准为2PN、第3天卵裂球数目7～9个、卵裂球大小均匀、细胞碎片<10%。
1.2.4 胚胎移植及冷冻 将挑选的优质胚胎移入囊胚培养液G2(Vitrolife，瑞典)后，进行超声引导下的胚胎移植，移植后仍有可利用的胚胎则进行玻璃化冷冻保存。移植后常规黄体支持。移植后14 d血β-HCG确定生化妊娠，移植后4周超声检查宫腔内若见孕囊及心管搏动，即可确定临床妊娠[6]。
1.3 观察指标 记录获卵数、成熟卵数、2PN卵数、2PN卵裂数、异常受精卵数、优质胚胎数、可利用胚胎数、移植胚胎数、冷冻胚胎数、胚胎种植数目等。卵母细胞成熟度=成熟卵数/获卵数×100%；2PN受精率=2PN卵数/成熟卵数×100%；2PN卵裂率=2PN卵裂数/2PN卵数×100%；异常受精率=异常受精卵数/成熟卵数×100%；优胚率=优质胚胎数/2PN卵裂数×100%；可利用胚胎率=(移植胚胎数+冷冻胚胎数)/2PN卵裂数×100%；胚胎种植率=胚胎种植数目/移植胚胎数×100%；临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数×100%。
1.4 统计学方法 应用SPSS 17. 0统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2.1 ICSI+AOA周期一般情况 行ICSI联合AOA激活周期23个，共获得卵母细胞267个。成熟卵数214个，成熟程度为80.1%；2PN卵数113个，2PN受精率为52.8%；2PN卵裂率97.3%；异常受精卵数12个，异常受精率为5.6%；优质胚胎数51个，优质胚胎率46.4%；可利用胚胎数74个，可利用胚胎率为67.3%；移植周期23个，临床妊娠率为39.1%；移植胚胎率41个，种植胚胎数12个，胚胎种植率29.3%。
2.2 A组和B组卵母细胞激活情况 A组获得卵母细胞82个，成熟卵数60个，成熟程度为73.2%；2PN卵数30个，2PN受精率为50.0%，2PN卵裂数93.3%；异常受精数3个，异常受精率为5.0%；优质胚胎数11个，优质胚胎率为39.3%；可利用胚胎数20个，可利用胚胎率71.4%；移植周期8个，妊娠周期1个，临床妊娠率12.5%；移植胚胎数14个，种植胚胎数1个，胚胎种植率7.1%。B组获得卵母细胞185个，成熟卵数154个，成熟程度为83.2%；2PN卵数83个，2PN受精率为53.9%，2PN卵裂数98.8%；异常受精数9个，异常受精率为5.8%；优质胚胎数40个，优质胚胎率为48.8%；可利用胚胎数54个，可利用胚胎率65.9%；移植周期15个，妊娠周期8个，临床妊娠率53.3%；移植胚胎数27个，种植胚胎数11个，胚胎种植率40.7%。B组胚胎种植率40.7%(11/27)明显高于A组的7.1%(1/14)，差异有统计学意义(χ2=3.098，P=0.023)。
3.1 ICSI受精失败的原因 ICSI受精失败是指精子注射入卵母细胞后，在一定的时间段内没有形成合子，且形态学上没有观察到雌雄原核形成的现象。ICSI受精失败的真正原因目前尚不清楚。虽然ICSI技术直接将精子注射入卵母细胞，解决了精子穿越透明带、精卵质膜融合等造成的受精失败的问题，但仍有20%～30%的卵母细胞行ICSI后不能正常受精[7]。ICSI仅解决了精子进入卵母细胞的问题，而要完成受精过程，精子必须在穿过透明带进入卵母细胞后激活卵子，完成第二次减数分裂并排出第二极体，在卵母细胞主导下，进行细胞和分子水平上的一系列变化，包括精子染色质去紧密化和精卵原核形成等，才能完成受精过程。因此，ICSI后受精失败的常见原因主要是卵母细胞激活失败。将行ICSI后未受精的卵母细胞进行荧光染色，可观察到其胞质内有不同程度去凝集状态的精子染色质，说明精子已经进入卵母细胞，但由于各种原因造成诱发钙离子振荡失败或振荡频率异常导致卵母细胞激活失败：①卵母细胞核质发育不同步造成的活化异常，卵母细胞核成熟的标志是排出第一极体，而此时胞核并没有完全成熟，导致胞核和胞质发育不同步，无法进行第二次减数分裂，有研究证实卵母细胞胞质内含有的凝集因子，如促进成熟因子(maturation-promoting factor,MPF)可使精子发生早熟染色体凝集，也可导致雄原核形成失败；②精子的异常，近年来的实验证实将精子赤道板区含有的磷脂酶C-ζ(phospholipase C-zeta，PLC zeta)直接注入卵母细胞可以诱发与受精过程相类似的钙振荡，当精子缺乏PLC zeta时则不能诱发钙振荡，从而导致受精失败[8-9]。本研究排除了前次ICSI受精失败的非激活障碍者，如卵母细胞本身质量差或畸形以及获得成熟的卵母细胞数目过少(<3枚)。
3.2 受精失败与辅助卵母细胞激活 当卵母细胞存在激活障碍时，可用辅助方法激活卵母细胞，包括行ICSI后加用钙离子载体、含高浓度钙离子的培养基、电刺激辅助激活卵母细胞等[10]。化学激活是指在培养液中添加外源性的化学激活剂，如乙醇、钙离子载体等。卵母细胞化学激活途径之一是钙离子信号通路，即通过化学激活剂诱导卵母细胞内钙离子浓度升高从而实现卵母细胞激活。钙离子浓度在卵母细胞胞浆内的升高是卵母细胞被激活后的初始信号，直接注射钙离子或应用钙离子载体A23187均能诱发哺乳动物卵母细胞孤雌激活和原核形成[11]。这一激活途径是由单脉冲性钙离子升高所激发的，钙离子通过跨膜转运，触发钙离子内流，在卵母细胞内迅速形成单脉冲性钙波，使MPF和丝裂原活化蛋白激酶等活性短暂下降，有利于皮质反应，启动DNA合成、受精卵分裂、胚胎的发育[12]。
卵母细胞辅助化学激活可以显著改善由于卵母细胞未能激活导致的行ICSI后受精失败或受精率低下，并可提高单倍体精细胞体外受精率及胚胎发育潜能。使用化学激活剂可显著提高ICSI后受精失败或受精率低下者的卵母细胞受精率和妊娠率[13]。Ozil等[14]发现，通过钙离子载体A23187激活ICSI受精失败或低受精者的卵母细胞能显著提高其受精率，并且经过激活的胚胎卵裂率，使可利用胚胎和优质胚胎率升高，从而增加临床妊娠的可能性。
本研究采用的是化学激活的方法，对8例前次ICSI受精失败患者进行了ICSI+AOA，2PN受精率为50.0%，2PN卵裂率为93.3%，优胚率为39.3%，可利用胚率为71.4%，取得了良好的效果。但临床妊娠率和种植率尚未达到理想水平，分析原因：8例卵母细胞成熟程度为73.2%，明显低于常规的促排卵水平，其卵子发育可能存在一定的问题，尽管最终有优胚和可利用胚，但胚胎的种植潜能低下而导致临床妊娠率和种植率低。
3.3 圆头精子症与辅助卵母细胞激活 文献报道，学者于1971年首次描述了圆头精子电镜下的形态结构，即圆头、无顶体和圆形精子核。在光学显微镜下可见多种多样的圆头精子，其中超大圆头精子多为精子头前1/3淡染为主，较小圆头精子多以精子头深染为主，同时还可见短尾、粗尾、双头或三头的圆头精子。在普通光学显微镜下若发现所有精子均为圆头可以初步判定为圆头精子症，为进一步明确诊断可以进行电镜或者染色观察是否存在精子顶体的缺失。近几年的研究证实圆头精子症顶体无法形成是由于相关基因的缺失造成的，导致精子高尔基体无法形成顶体，表现为精子圆头且尾部畸形[15]。
圆头精子症者通过ICSI技术可以获得了一定的临床妊娠率，但是其成功率要远低于正常的ICSI治疗者。在圆头精子症的ICSI治疗中，发现其受精率明显降低，甚至可出现完全不受精者。通过文献检索发现1994—2004年共完成54周期圆头精子症的ICSI治疗，其中完全受精失败的有9个周期(受精率为0)。在小鼠模型研究中发现，将用圆头精子受精失败的小鼠卵母细胞进行8%乙醇人工卵母细胞激活，可以得到较好的受精效果。在ICSI后使用钙载体进行卵母细胞激活，可以显著提高圆头精子的受精率[16]。有学者认为精子对卵母细胞的激活，主要与受精时精子引导的钙离子内流有关，而用圆头精子进行ICSI时钙离子内流会降低或缺失，导致卵母细胞激活失败。本研究中因精子畸形如圆头精子症行ICSI+AOA者15例，卵子成熟程度为83.2%，达到同期促排卵水平，说明女方的卵子情况基本正常，不育的原因为男方因素；2PN受精率为53.9%，异常受精率为5.8%，2PN卵裂率为98.8%，优胚率为48.8%，可利用胚率为65.9%，临床妊娠率为53.3%，移植胚数27个，种植率为40.7%。2PN受精率偏低、异常受精率偏高，说明精子的形态对于受精起到关键的作用，除了激活障碍，可能还存在受精障碍的其他原因。而一旦形成优质胚胎后胚胎的发育潜能较好，可获得较好的临床妊娠率和种植率。
总之，AOA提高了辅助生殖技术中的卵母细胞受精率和胚胎发育潜能，尤其对于特殊的适应人群，但同时也有某些还需重视的问题，如子代的安全性问题[17]。虽有一些研究报道，采用化学激活后出生的婴儿外观正常，并有正常的染色体，但大多是个案报道，还需进一步的大样本研究。目前，在尚未有更理想的治疗方法改善ICSI完全受精失败和严重精子畸形(如圆头精子症)者的受精率及胚胎发育质量之前，AOA对临床应用有一定的价值，是治疗可能存在卵母细胞激活异常者的方法之一。
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