微小RNA(microRNA,miRNA)是一类长18～25个核苷酸的非编码小RNA，通过靶向作用于靶基因的3′非编码区，在转录后水平抑制靶基因的表达，包括阻止靶基因的翻译及加速靶基因的降解。miRNA参与了肿瘤发展的各个过程，包括细胞生长、细胞凋亡、代谢和发育。miR-140-5p参与多种肿瘤的发生发展，在胶质母细胞瘤、膀胱癌、喉鳞状细胞癌中表达降低，在多种癌症中发挥着抗肿瘤作用，但其在前列腺癌中的表达及作用尚无相关研究。本研究检测miR-140-5p在前列腺细胞株中的表达，探讨其生物学功能，旨在为临床治疗前列腺癌提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 细胞培养 PC3细胞、DU145细胞、RWPE-1细胞培养在含有双抗(青霉素和链霉素)及10%胎牛血清的RPMI 1640培养液中，293A细胞培养在含有双抗(青霉素和链霉素)及10%胎牛血清的DMEM培养液中，放入37 ℃、5% CO2培养箱内。每1～2 d更换细胞培养液，待细胞达80%融合，用0.25%胰蛋白酶消化传代。根据细胞密度分装到新的细胞培养瓶中，放回培养箱继续培养。
1.2 试剂和仪器 RPMI 1640培养基(Gibco公司)；Lipofectamine 2000细胞转染试剂(Invitrogen公司)；胎牛血清(CLARK Bioscience公司)；CCK-8细胞增殖/毒性检测试剂盒(上海贝博生物)；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒(BD公司)；miRNA提取试剂盒(Omega 公司)；miRNA反转录及扩增试剂盒(广州富能基因)；核酸定量仪(德国Eppendorf公司)；PCR扩增仪(德国Eppendorf公司)；实时荧光定量PCR仪ABI 7500 Fast(美国ABI公司)。
1.3 引物设计及模拟物/抑制物的合成 miR-140-5p及U6上游引物及购自广州富能基因；miR-140-5p模拟物及抑制物购自上海吉玛公司。
1.4 方法
1.4.1 细胞转染 使用Lipofectamine 2000对细胞转染，PC3细胞接种到6孔板或96孔板中培养24 h，待细胞生长密度为60%～80%时进行转染。转染时首先应用无菌DEPC水将miR-140-p模拟物或抑制物进行溶解，并定容为50 pmol/mL。用无血清RPMI 1640分别稀释模拟物/抑制物以及Lipofectamine 2000转染试剂常温放置5 min。随后将含有模拟物/抑制物以及Lipofectamine 2000的RPMI 1640充分混合，常温静置15 min。其间将PC3细胞用无血清RPMI 1640培养基洗2次去除血清对转染的干扰，后用无血清RPMI 1640培养基进行换液，并将上述混合模拟物/抑制物以及Lipofectamine 2000的RPMI 1640培养基加入孔板中进行培养。转染6 h后，弃去孔板中的培养基，更换为新的无血清RPMI 1640培养基，继续放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h，收集细胞，进行下一步聚合酶链反应。
1.4.2 CCK-8法测定细胞增殖抑制率 将PC3细胞浓度调整至1×105 cells/mL，取100 μL接种于96孔培养板，并按“1.4.1”项下方法转染PC3细胞，在转染后0，12，24，48 h进行CCK8检测，每组设5个复孔。检测前每孔加入CCK-8试剂10 μL，继续培养2 h。酶标仪测定各个孔在450 nm处的光密度(optical density，OD)值，并计算细胞的增殖抑制率。
1.4.3 流式细胞术AnnexinV-FITC/PI检测细胞凋亡 PC3细胞按“1.4.1”项下转染方法转染miR-140-5p模拟物及抑制物48 h，收集细胞；PBS洗涤细胞；加入100 μL 1×Binding Buffer 悬浮细胞；加入5 μL Annexin V-FITC及5 μL PI染色混匀后，避光，室温孵育15 min；上机前，补加200 μL 1×Binding Buffer。每组设3个复孔。随后流式细胞仪检测细胞凋亡情况，并计算细胞凋亡率。
1.4.4 miRNA提取及实时定量PCR PC3细胞、DU145细胞及转染后的PC3细胞提取RNA。用于反转录的总RNA提取方法按照OMEGA miRNA Kit试剂盒提取说明进行。Nanodrop核酸定量仪检测RNA纯度和浓度，符合浓度及纯度的RNA进行反转录。miRNA反转录应用GeneCopoeia公司All-in-OneTM miRNA First-Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，取1～2 μg总RNA按说明书建立25 μg反转录体系合成cDNA。按照GeneCopoeia公司miRNA qPCR Kit试剂盒说明进行实时定量聚合酶链反应。以管家基因U6为内参，采用△Ct(Ct目的-Ct内参)法进行相对定量分析，以2-△△Ct作为目的RNA的相对表达量。
1.4.5 TCGA数据库分析 利用可视化TCGA数据库分析网站oncolnc(www.oncolnc.org)分析miR-140-5p在TCGA数据库中的表达与前列腺癌患者预后之间的关系，cutoff值选取为-25%～+25%。
1.5 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件处理数据。计量资料比较分别采用两独立样本的t检验、F检验和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 miR-140-5p在不同细胞株中的表达情况比较 miR-140-5p在DU145及PC3细胞中的表达明显低于RWPE-1细胞，miR-140-5p在PC3细胞中的表达明显低于DU145细胞，差异有统计学意义(P<0.05)。故选取PC3细胞作为后续实验细胞株。见表1。
表1 不同细胞株中miR-140-5p相对表达量
Table 1 Relative miR-140-5p expression
level in different cell lines 
细胞株miR-140-5p相对表达量RWPE-11.000±0.097PC30.491±0.042∗DU1450.669±0.049∗#F值211.899P值0.000
*P值<0.05与RWPE-1比较 #P值<0.05与PC3比较(SNK-q检验)
2.2 转染miR-140-5p模拟物能增加PC3细胞中miR-140-5p表达 转染miR-140-5p模拟物的PC3细胞中miR-140-5p相对表达量明显高于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。证实miR-140-5p模拟物转染效率高。见表2。
2.3 过表达miR-140-5p抑制PC3细胞增殖促进凋亡 miR-140-5p的模拟物转染PC3细胞48 h，过表达组细胞增殖率低于阴性对照组，凋亡率高于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。说明过表达miR-140-5p可抑制PC3细胞增殖，促进其凋亡。见表3。
表2 转染miR-140-5p模拟物对PC3细胞中
miR-140-5p相对表达量影响
Table 2 Relative miR-140-5p expression level in PC3 cells
after transfection with miR-140-5p mimic
组别miR-140-5p相对表达量阴性对照组1.000±0.097转染组499.811±7.942t值1 411.839P值0.000
表3 转染miR-140-5p模拟物对PC3细胞增殖及凋亡影响
Table 3 Effect on cell viability and apoptosis after
transfection with miR-140-5p mimic 
组别增殖率凋亡率阴性对照组80.83±3.1210.83±0.92过表达组 63.27±4.4515.27±1.45t值1 419.819119.239P值0.0000.000
2.4 转染miR-140-5p抑制物能敲低PC3细胞中miR-140-5p表达 转染miR-140-5p抑制物的PC3细胞中miR-140-5p相对表达量明显低于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。证实miR-140-5p抑制物敲低效率高。见表4。
表4 转染miR-140-5p抑制物对PC3细胞中
miR-140-5p相对表达量影响
Table 4 Relative miR-140-5p expression level
after tranfection with miR-140-5p inhibitor
组别miR-140-5p相对表达量阴性对照组1.000±0.097转染组0.391±0.021t值 211.839P值 0.000
2.5 敲低miR-140-5p表达促进PC3细胞增殖抑制凋亡 敲低miR-140-5p表达组细胞增殖率明显高于阴性对照组，凋亡率明显低于阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。说明敲低miR-140-5p表达可促进PC3细胞增殖，抑制其凋亡。见表5。
表5 转染miR-140-5p抑制物对PC3细胞增殖及凋亡影响
Table 5 Effect on cell viability and apoptosis after transfection with miR-140-5p inhibitor
组别增殖率凋亡率阴性对照组79.51±4.1211.24±1.14敲低组 87.27±6.457.41±1.01t值89.819119.239P值0.0000.000
2.6 低表达miR-140-5p和前列腺癌患者预后不良的相关性 通过TCGA数据库分析86例前列腺癌患者miR-140-5p的表达情况，结果显示低表达miR-140-5p组患者(n=43)总生存率低于高表达miR-140-5p组患者(n=43)，差异有统计学意义(P=0.015)。
3 讨 论
前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一。据统计，2017年全美国前列腺癌新增发病人数位居癌症发病率首位，死亡人数排名第二[1-2]。我国前列腺癌的发病率和检出率也呈逐年升高趋势，已位居男性泌尿生殖系统恶性肿瘤的第3位[3]。随着前列腺特异性抗原筛查和手术进步以及放化疗技术、去雄激素治疗的进展，前列腺癌患者的5年存活率明显提高。但超过50%患者出现去势治疗抵抗、化疗耐药，进而出现疾病进展复发、转移及浸润，威胁患者生命[4]。因此，进一步研究前列腺癌发病机制，有助于寻找更多的治疗方法。
miRNA，作为重要的非编码RNA，通过靶向结合在靶基因3′非编码区，诱导靶基因mRNA降解剂抑制靶基因翻译，发挥着重要的转录后调控作用[5]。miRNA参与了多种疾病(包括心血管疾病、糖尿病、神经退行性疾病及肿瘤)的发生发展[6]。已有研究证实，miRNA参与了前列腺癌发生发展的多个过程，包括增殖、迁移、侵袭、凋亡等[7]，如在前列腺癌组织中miR-100表达量明显降低，在前列腺癌细胞中过表达miR-100后，可通过靶向抑制AGO2基因表达，抑制前列腺癌细胞上皮间质转化[8]。Gao等[9]证实，miR-323在前列腺癌中高表达，过表达miR-323能促进前列腺癌细胞等增殖及进展。Hao等[10]发现，异常表达miR-211/SPARC 通路可能在前列腺癌进展中发挥重要作用。此外，miRNA可能作为生物学分子标记物与前列腺癌的耐药及预后密切相关。罗振国等[11]比较了前列腺癌患者与前列腺增生患者血清中的miR-107水平，发现高表达miR-107可作为前列腺癌的特异指标。Tinay等[12]分析了miR-345-5p在前列腺癌患者血清中的表达，发现高表达miR-345-5p与前列腺癌患者预后不良相关，其原因可能与miR-345-5p靶向抑制CDKN1A表达、促进前列腺癌细胞增殖与侵袭有关。本研究结果显示，在前列腺癌细胞中，miR-140-5p表达明显降低，通过分析TCGA数据可也可得知，前列腺癌患者低表达miR-140-5p预后不良，故miR-140-5p可能作为潜在的分子生物学预后指标在前列腺癌评价中应用。
miR-140-5p在多种恶性肿瘤中表达下调，发挥抑癌基因作用，并可能与患者预后相关。如miR-140-5p在子宫颈癌中表达降低[13]；miR-140-5p在食管癌中低表达，并参与了食管癌的侵袭、迁移及上皮间质转化[14]；miR-140-5p在胃癌中表达降低，并且与胃癌患者生存可能存在关系[15]。本研究结果显示，miR-140-5p在前列腺癌中低表达，并与前列腺癌患者预后不良有关。
一个miRNA可能调控多个靶基因，同时一个基因受到多种miRNA调控。miR-140-5p在不同癌症细胞中的作用也不尽相同。miR-140-5p通过靶向作用于YES1基因，参与了胃癌的迁移及侵袭等恶性过程[16]；另外，在卵巢癌中，过表达miR-140-5p可明显靶向作用于PGDFA 3′非编码区，抑制其蛋白等表达，进而抑制卵巢癌细胞等增殖[17]；miR-140-5p还能通过靶向抑制VEGF-A等表达，调控非小细胞肺癌等癌症进展[18-19]。本研究结果显示，在PC3细胞中过表达miR-140-5p，能够明显促进PC3细胞凋亡，抑制其增殖；而敲低miR-140-5p，能促进PC3细胞增殖，抑制其凋亡。但miR-140-5p下游基因及进一步调控机制，还需要更多实验证实。
综上所述，miR-140-5p在前列腺癌细胞中表达明显降低，过表达miR-140-5p能促进前列腺癌细胞凋亡，低表达miR-140-5p与前列腺癌患者预后不良相关，这为临床治疗前列腺癌提供了新的思路。
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