下肢原发性慢性静脉功能不全(primary chronic venous insufficiency，PCVI)是血管外科常见病与多发病，是以浅静脉曲张、静脉性跛行、肢体水肿、胀痛、皮肤湿疹、脂质硬化和溃疡等为主要表现的一种疾病, 在西方国家约三分之一成人罹患静脉曲张(其中绝大多数为PCVI)，国内报道此病发生率约为8.6%[1-3]。其病因及发病机制至今未明。本研究通过检测上皮钙黏附蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)在曲张大隐静脉组织及正常大隐静脉组织中的表达情况，探讨PCVI与上皮间质转化(epithelial mesenchimal transition，EMT)之间的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2012年2—10月我院收治的67例PCVI患者曲张大隐静脉小腿段2～3 cm血管壁作为试验组标本，均采取无损伤原则切取。根据1994年美国静脉学会(Clinical Etiology Anatomy Pathophysiology，CEAP)临床分级法[4]：2级28例，3级6例，4级15例，5级8例，6级10例。按照静脉临床严重程度评分(Venous Clinical Severity Score，VCSS)[5]：轻度PCVI组(1～2级) 28例，男性12例，女性16例，年龄37～74岁，平均(55.59±8.22)岁，毛细血管扩张与浅静脉曲张；中度PCVI组(3～4级) 21例，男性9例，女性12例，年龄37～75岁，平均(56.60±7.48)岁，患肢有水肿及皮肤改变，片状色素沉着、静脉湿疹及脂质硬化等；重度PCVI组(5～6级) 18例，男性7例，女性11例，年龄38～74岁，平均(55.48±8.41)岁，患肢有水肿、皮肤改变、已愈合溃疡及活动动性溃疡。另选择同期行冠状动脉搭桥及其他搭桥手术中取大隐静脉作供体移植者16例作为对照组，均无外周血管疾病，男性10例，女性6例，年龄49～68岁，平均(56.30±6.84)岁。每例标本于手术切下后立即存于液氮罐中冻存。4组性别、年龄差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
1.2 主要试剂 RNA提取试剂Trizol Reagent(美国Invitrogen公司),RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit、聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction， PCR) Master Mix(美国Fermentas公司)，E-cadherin，Vimentin和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物均由上海生工生物公司合成。鼠抗人E-cadherin单克隆抗体、兔抗人Vimentin单克隆抗体(美国Abcam公司)，鼠抗人GAPDH单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG及羊抗鼠IgG购自北京中杉金桥生物技术有限公司，放射免疫沉淀法(Radioimmunoprecipitation assay，RIPA)蛋白裂解液,彩色预染蛋白质分子量标准， 电化学发光(electrochemiluminescence, ECL)液等购自上海碧云天生物技术有限公司。
1.3 方法
1.3.1 半定量逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR) 将大隐静脉用液氮研磨成粉状后，用Trizol Reagent提取组织总RNA，通过RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒逆转录大隐静脉组织总RNA为cDNA，PCR反应扩增基因片段，PCR产物行凝胶电泳，GAPDH作内参照，用与GAPDH灰度值比值对mRNA的表达进行半定量分析。E-cadherin反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行40个循环，72 ℃再延伸5 min。Vimentin反应条件：95 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行30个循环，72 ℃再延伸5 min。GAPDH反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，进行30个循环，72 ℃再延伸5 min。扩增后取5 μL PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳。凝胶自动成像系统上摄像,通过Quantity one分析各条带灰度值(基因表达值=E-cadherin或Vimentin/GAPDH)。
1.3.2 Western blot 将大隐静脉用液痰研磨成粉状后装入1.5 mL离心管中，按每100 mg组织加1 mL冷RIPA裂解液，于冰上充分裂解30 min，15 000 g，4 ℃离心7 min，取上清以二奎啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)法测定蛋白质含量。取50 μg蛋白经煮沸5 min，加适量上样缓冲液后，7.2%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺垂直凝胶电泳分离，电转移蛋白质到聚偏二氟乙烯膜上，5%脱脂奶粉液封闭，37 ℃室温1 h，洗膜缓冲液洗膜后分别与抗E-cadherin抗体(1∶1 000)、抗Vimentin抗体(1∶1 500)和抗GAPDH抗体(1∶1 000)孵育4 ℃过夜，再用辣根过氧化物酶标记的二抗孵育，37 ℃ 1 h，洗膜缓冲液洗膜后在暗室中加ECL发光试剂，X线胶片下曝光，常规方法显影、定影。图像分析通过Quantity one分析各条带灰度值(蛋白表达值=E-cadherin或Vimentin/GAPDH)。
1.4 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件分析数据。计量资料比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 E-cadherin mRNA和Vimentin mRNA在大隐静脉标本中的表达情况 通过半定量RT-PCR法扩增目的基因E-cadherin基因、Vimentin基因及内参照GAPDH基因，E-cadherin基因扩增产物在琼脂糖凝胶上表现为大小293 bp条带，Vimentin基因扩增产物在琼脂糖凝胶上表现为大小272 bp条带，GAPDH基因扩增产物表现为大小532 bp条带，条带大小符合预期引物设计结果。轻度PCVI组、中度PCVI组、重度PCVI组E-cadherin mRNA扩增平均灰度值低于对照组，中度PCVI组、重度PCVI组E-cadherin mRNA扩增平均灰度值低于轻度PCVI组，重度PCVI组E-cadherin mRNA扩增平均灰度值低于中度PCVI组，差异有统计学意义(P<0.01)。正常对照组、轻度PCVI组、中度PCVI组、重度PCVI组中组织标本表达Vimentin mRNA差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 各组大隐静脉标本中E-cadherin mRNA的 平均灰度值比较
Table 1 E-cadherin mRNA and Vimentin mRNA expression in great saphenous vein samples
组别例数E-cadherin mRNAVimentin mRNA对照组 160.630±0.1340.244±0.132轻度PCVI组280.500±0.107*0.448±0.607中度PCVI组210.352±0.103*#0.326±0.248重度PCVI组180.188±0.097*#△0.318±0.274F值 54.0390.992P值 <0.0010.401
*P值<0.05与对照组比较 #P值<0.05与轻度PCVI组比较 △P值<0.05与中度PCVI组比较(SNK-q检验)
2.2 E-cadherin与Vimentin在大隐静脉标本中的表达情况 通过Western Blot法检测目的蛋白E-cadherin、Vimentin及内参照GAPDH，E-cadherint和Vimentin及GAPDH分别为110 000,53 000,36 000条带，符合抗体说明书大小。轻度PCVI组、中度PCVI组、重度PCVI组E-cadherin表达平均灰度值低于对照组，中度PCVI组、重度PCVI组E-cadherin表达平均灰度值均低于轻度PCVI组，重度PCVI组E-cadherin表达平均灰度值均低于中度PCVI组，差异有统计学意义(P<0.01)。Vimentin在正常对照组、轻度PCVI组、中度PCVI组、重度PCVI组中表达差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 E-cadherin和Vimentin在大隐静脉标本中的表达
Table 2 Expression of E-cadherin and vimentin in saphenous vein
组别例数E-cadherinVimentin对照组160.754±0.1934.185±2.256轻度组280.484±0.110*5.023±3.525中度组210.382±0.120*#4.728±3.363重度组180.220±0.125*#△4.972±4.379F值45.4590.219P值<0.0010.883
*P值<0.05与对照组比较 #P值<0.05与轻度PCVI组比较 △P值<0.05与中度PCVI组比较(SNK-q检验)
3 讨 论
3.1 EMT和PCVI均与基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)关系密切，假想PCVI通过EMT介导血管重塑作用 EMT是指上皮细胞在形态学上发生向成纤维细胞或间质细胞表型的转化过程，即具有极性的上皮细胞经历多种生化转变成具有间质细胞表型的一个过程[6]。上皮细胞在EMT过程中发生表型标志改变，主要包括上皮细胞分子标志的表达降低或丧失和一些间叶细胞标志的新表达或表达升高。EMT时，介导细胞间及细胞基质间连接的E-cadherin和维持细胞极性的细胞角蛋白表达下调，而参与基底膜降解的成纤维细胞特异蛋白1、Vimentin、α-平滑肌肌动蛋白及细胞外基质成分(Ⅰ型胶原蛋白、纤连蛋白等)新表达或表达上调， E-cadherin表达减少甚至丢失是EMT最显著的特征之一[7]。
关于PCVI的发病原因目前有以下几种学说：①静脉瓣膜学说；②静脉管壁学说；③动静脉交通学说；④血管重塑学说。其中血管重塑学说是近年来的研究热点，即血管重塑是细胞增殖、死亡、迁移以及细胞外基质合成和降解所致的血管壁结构动态变化过程。国内外曲张静脉组织学特点发现，曲张静脉发生的病理变化表现为内皮细胞排列疏松甚至脱落，中层平滑肌细胞增厚等。正好与EMT过程中上皮细胞间连接减少，容易脱落，逐渐转变为间质细胞等特点相吻合。另外国内外大量研究证实[8-13]，MMP与静脉曲张的血管重塑过程关系密切，许建辉等[8]研究发现，MMP-1在正常大隐静脉壁中表达量较少，但在曲张大隐静脉壁中表达量增多；刘群亮等[9]研究表明，MMP-2、MMP-9和基质金属蛋白酶组织抑制因子1在曲张静脉壁中表达增多，证实其在慢性静脉功能不全中起重要作用，可能参与血管重塑的发生和发展；Schmid-Schönbein等[10]在静脉性溃疡周围组织的检测中发现MMP-9表达增加，且与溃疡愈合程度呈负相关。上述研究结果均表明MMPs在静脉曲张血管重塑重构过程中起作用。但具体作用机制，即如何发挥作用仍不清楚。近年来通过对EMT的研究发现，MMP与EMT关系密切，其在多种条件下介导EMT的发生。如Radisky等[14]报道，将小鼠乳腺上皮细胞暴露于MMP-3中,将诱导一种Rac1转换形式的表达,通过一系列效应刺激转录因子Snail的表达而诱导EMT的发生。Moirangthem等[15]报道，MMP-9表达越高，表达 E-cadherin量越少，通过MMP-9调控EMT的表达可降低乳腺癌的发展。Ke等[16]研究显示，MMP-7有助于肾脏纤维化病变可能正是通过诱导调节EMT来实现的。正是基于PCVI与MMP密切关系，以及MMP在EMT中的重要作用，猜测PCVI可能与EMT有关，即EMT参与PCVI的血管重塑过程。
3.2 通过检测经典EMT标志物验证PCVI的血管重塑是否经EMT介导 EMT有2个经典标志物，即上皮细胞标志物E-cadherin和间质细胞标志物Vimentin。本研究通过测定E-cadherin和Vimentin转录水平及翻译水平的表达量来检测EMT的发生，采用Western blot 及 RT-PCR的方法检测标本中E-cadherin和Vimentin 的转录水平与翻译水平，结果表明，E-cadherin在正常对照组及轻度PCVI组，中度PCVI组，重度PCVI组中表达逐渐降低(P<0.01)，但是Vimentin在各组间差异无统计学意义(P>0.05)。不符合EMT过程中E-cadherin下调并且Vimentin上调的情况，表明在PCVI的静脉重塑过程不是通过EMT实现的。但也同时表明，①作为内皮细胞间主要成分的E-cadherin减少，导致内皮细胞间连接疏松，可能后续的血管内成分渗出而出现的色素沉着及静脉性溃疡有关；②PCVI的静脉重塑过程中，上皮细胞即下肢静脉内皮受损严重，而间质细胞标志物Vimentin表达无明显变化，提示其在形态学中表现出的中层增厚可能是以结构变化为主,平滑肌细胞数量上并无明显的增加。
E-cadherin在正常对照组与轻度PCVI组、中度PCVI组、重度PCVI组中表达，随着临床严重程度加重而呈降低趋势，提示E-cadherin与PCVI的临床症状相关，可作为临床评估PCVI严重程度的指标。同时，进一步找出内皮细胞受损的机制，可能为PCVI的发病机制提供新的思路。而间质细胞形态学增厚，表达产物却未进一步增加，需要进一步研究。
总之，PCVI的静脉重塑可能并不是以EMT实现的，但是E-cadherin作为内皮细胞的表型标志，随PCVI临床表现严重程度增加而降低，可作为评PCVI临床严重程度的一项指标。
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