乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，根据国家癌症中心发布的最新数据显示，乳腺癌的发病率已跃居女性恶性肿瘤首位[1-2]。目前，乳腺癌的治疗方案有手术治疗、放疗、化疗、内分泌治疗、生物治疗等[3-5]。临床医生根据病理诊断、结合临床情况选择最理想的治疗方案。在原发肿瘤的引流区域有一批具有肿瘤转移防御屏障功能特殊的淋巴结，它是原发肿瘤转移所必经的第一批巴结，被称为前哨淋巴结。前哨淋巴结是否发生转移对决定手术范围、选取治疗方案有着重要作用。因此，除了对术中切除肿瘤的明确病理诊断外，作为病理医师还应对前哨淋巴结是否发生转移的病理诊断亦尤为重要。对乳腺癌术中淋巴结进行冰冻切片、苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE染色)时，病理诊断医师易漏检微小转移灶。淋巴结的实质有皮质和髓质构成，其细胞构成主要有网状细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞T淋巴细胞以及浆细胞等。上皮细胞标志物广谱细胞角蛋白 (cytokeratin，CK)(AE1/AE3)阳性表示发生上皮转移。笔者利用免疫组织化学染色的方法对乳腺癌患者术中切除前哨淋巴结进行CK(AE1/AE3)标记，并探讨其重要性。
1 资料与方法
1.1 标本来源 选取2017年6月—2018年5月我院乳腺癌术中切除前哨淋巴结组织1 569枚。本研究取得受试者或其家属的知情同意并签署知情同意书，通过医院伦理委员会批准。
1.2 仪器与试剂 Leica CM3050S 冷冻切片机，Leica PELORIS 全封闭脱水机，Leica EG1150H+C组织包埋机，Leica RM2245切片机， Leica DM3000生物显微镜均够自德国徕卡公司；TKY-TKA摊片烤片机，购自湖北泰康医疗设备有限公司；Linistat 线性染色机购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；Benchmark XT全自动免疫组织化学染色平台购自瑞士罗氏。苏木素染液、伊红染液均购自珠海贝索生物技术有限公司；CK(AE1/AE3)抗体购自迈新生物技术开发有限公司；苏木素染色液，返蓝染色液，DAB染色液均够自罗氏诊断产品(上海)有限公司。
1.3 实验方法 对收集到的468例乳腺癌患者术中切除的1 585枚前哨淋巴结组织进行冰冻切片、HE染色。病理科接收到乳腺癌患者术中切除的前哨淋巴结及时使用适量OCT包埋剂进行包埋固定于样品托，并置冰冻切片机的冷冻台上，待组织完全冷冻后，将样品托固定于机头，进行切片5～10 μm，切片后进行冰冻HE染色。由病理诊断医师进行HE阅片，待该患者冰冻报告签字发放以后，将冰冻剩余组织从冰冻切片机内取出，放流水下进行解冻，洗去附着在组织周围的OCT包埋剂。将去除OCT包埋剂的冰冻剩余组织放入对应病理号的包埋小盒中，浸泡于10%中性福尔马林，进行规范化脱水、透明、石蜡包埋组织块。见表1。
表1 组织脱水运行程序
Table 1 Organizational dehydration operation procedures
步骤试剂名称时间(min)温度(℃)压力搅拌速度滴液时间(s)1福尔马林9045常压中速10285%乙醇6045常压中速10395%乙醇6045常压中速104无水乙醇6045常压中速105无水乙醇6045常压中速106无水乙醇6045常压中速107无水乙醇6045常压中速108二甲苯30常温常压中速109二甲苯30常温常压中速1010石蜡9063负压中速3011石蜡9063负压中速3012石蜡9063负压中速30总脱水时间:13 h 25 min
将组织脱水完成后的前哨淋巴结冰冻剩余组织利用连续切片法( step/serialsection,SS)进行切片4 μm，其中第1张做HE染色，第2张做免疫组织化学CK(AE1/AE3)标记，第3张做HE染色。由病理诊断医师进行HE阅片，两张HE切片肿瘤占比一致时，该样本信息纳入统计。根据最新版美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)分期及TNM分期将乳腺癌腋窝淋巴结转移的情况分为3种进行判读：① 联合国开发计划署(International Trade Center,ITC)指在前哨淋巴结内1个切面上出现的单个肿瘤细胞或细胞簇，直径<0.2 mm或<200个肿瘤细胞；②微转移是指前哨淋巴结内一个切面上出现直径为0.2～2 mm或>200个肿瘤细胞的转移灶；③宏转移，是指前哨淋巴结内转移的肿瘤直径>2 mm。
1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0统计学软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
1 585枚前哨淋巴结组织冰冻HE染色，剩余组织经过规范化脱水、透明、石蜡包埋组织块。冰冻组织HE染色、石蜡组织免疫组织化学CK(AE1/AE3)标记均发现肿瘤转移93例；冰冻组织HE染色未发现肿瘤转移、石蜡组织免疫组织化学CK(AE1/AE3)标记发现淋巴结微转移36个；冰冻组织HE染色未发现肿瘤转移、石蜡组织免疫组织化学CK(AE1/AE3)标记发现孤立性肿瘤细胞簇54个；冰冻报告为淋巴结可疑转移5例，经免疫组织化学染色CK(AE1/AE3)标记显示3例未发生转移； 冰冻组织HE染色、石蜡组织免疫组织化学CK(AE1/AE3)标记均未发现肿瘤转移1 397例。石蜡组织免疫组织化学CK(AE1/AE3)标记发现淋巴结转移显著高于冰冻组织HE染色(P<0.01)。石蜡组织免疫组织化学CK(AE1/AE3)标记检测淋巴结转移的阳性率为11.672%，冰冻组织HE染色检测淋巴结转移的阳性率为6.183%。经HE染色和免疫组织化学CK(AE1/AE3)标记结果见图1，统计结果见表2。
图1 乳腺癌前哨淋巴结染色结果
A.冰冻组织HE染色报告淋巴结未发现肿瘤转移;B.免疫组织化学CK(AE1/AE3)标记阴性显示淋巴结未发现肿瘤转移；C.冰冻组织HE染色报告为淋巴结未发现肿瘤转移;D.免疫组织化学CK(AE1/AE3)标记阳性显示淋巴结有孤立性肿瘤细胞簇；E.冰冻组织HE染色报告淋巴结可疑发现肿瘤转移;F.免疫组织化学CK(AE1/AE3)标记阴性显示淋巴结有肿瘤微转移;G.冰冻组织HE染色报告淋巴结发现有肿瘤宏转移;H.免疫组织化学CK(AE1/AE3)标记阴性显示淋巴结发现有肿瘤转移
Figure 1 Sentinel lymph node staining in breast cancer
表2 使用HE和免疫组织化学两种检测方法比较前哨淋巴结转移率
Table 2 Comparison of sentinel lymph node metastasis rates using HE and immunohistochemistry (n=1 585，例数)
免疫组织化学染色苏木精-伊红染色+-阴性(-)31 397孤立性肿瘤细胞(+)054微转移(+)036宏转移(+)950χ2 值736.654P值<0.001
3 讨 论
乳腺癌通过淋巴血管系统转移到腋窝的区域淋巴结及内脏和非内脏部位。肿瘤细胞进入血液和淋巴毛细血管的途径目前仍是解剖学、病理学、遗传学、流行病学和分子水平上进行研究的热点。
有研究表明，在乳腺癌患者中，前哨淋巴结未转移，术后腋窝淋巴结发生转移的概率极低，可不行腋窝淋巴结清扫[6]。Donker等[7]研究表明，在乳腺癌患者中，前哨淋巴结阳性，可行腋窝淋巴结清扫术(axillary lymph node dissection，ALND)或腋窝放疗，有较好、疗效相当的局部控制，且腋窝放疗后的淋巴结水肿发生率较低。Falco等[8]研究发现，前哨淋巴结活组织检查阳性转移的直径，是乳腺癌早期腋窝肿瘤负荷较强的预测因子。Sykes等[9]的研究报告指出前哨淋巴结活组织检查在临床常规中是可行的，而手术切除的前哨淋巴结阴性也可能与外阴癌的复发相关，因此为确保患者的安全，应严格遵守病理规范化操作。2017年4月在旧金山举行的第七届癌症转移国际研讨会上有观点提出肿瘤细胞可能直接进入全身血管，直至颈部的中央淋巴静脉吻合[10-11]。在这些实验小鼠转移模型中，肿瘤细胞通过向外侵袭，侵入前哨淋巴结活组织检查内的血管，进入血液循环并定植肺部。因此，前哨淋巴结是否发生转移或微转移，对于临床治疗方案的选择及预后评估至关重要，在前列腺癌、子宫内膜癌、胃癌、头颈部皮肤鳞癌等肿瘤的复发风险及预后评估中也同样重要[12-14]。但在高风险皮肤鳞状细胞癌在评估后期系统性癌症扩散的风险、进展和远处转移中，前哨淋巴结活组织检查并不是一个可靠的诊断方法[15]。
目前，对于前哨淋巴结是否发生转移的鉴别方法有超声造影、双能CT定量、声触诊组织量化技术等[16-17]。另外，单步核酸扩增法(one-step nucleic acid amplification ,OSNA)是近年来靶向CK19 mRNA检测淋巴结转移的新方法[18]。免疫组织化学染色法在病理诊断工作中是常见的染色方法，是将抗体与荧光或可呈色的化学物质结合，利用抗原和抗体间专一性结合的免疫学原理，检测组织或细胞中是否有目标抗原的存在。利用此方法检测组织切片中肿瘤标志物的免疫组织化学染色结果，从而判断该组织是否存在肿瘤。Schweinzer等[19]研究发现，应用免疫组织化学标记CK(AE1/AE3)联合三维组织学检查，可提高增生性鳞状细胞癌(desmoplastic squamous cell carcinoma,DSCC)的诊断水平。
本研究结果显示，在冰冻组织HE染色未发现肿瘤转移，而石蜡组织免疫组织化学CK(AE1/AE3)标记发现孤立性肿瘤细胞簇54个，淋巴结转移36个；冰冻报告为淋巴结可疑转移5例，经免疫组织化学染色CK(AE1/AE3)标记显示3例未发生转移，为临床提供了更加明确的诊断结果，减少漏诊率。Nathanson等[20]认为肿瘤细胞通过前哨淋巴结进入循环系统，微转移灶及孤立的肿瘤细胞的存在为肿瘤细胞发生远处转移提供条件，对于乳腺癌患者的预后有重要影响。Wong等[21]研究也表明，新辅助治疗后前哨淋巴结冰冻切片诊断与非新辅助治疗组前哨淋巴结冰冻切片诊断具有同等的敏感性、特异性和准确性，前哨淋巴结冰冻切片诊断对临床医生有很重要的指导意义。
因此，在乳腺癌患者前哨淋巴结中进行免疫组织化学染色CK(AE1/AE3)标记，降低HE染色的假阳性率，有助于孤立性肿瘤细胞的检出，提高诊断淋巴结转移的准确率，从而有效的辅助病理诊断，为临床治疗方案的选取提供依据。
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