单羧酸转运蛋白1(monocarboxylate transporter 1，MCT1)是单羧酸转运蛋白家族成员，可通过介导乳酸的跨膜转运在糖酵解过程中发挥着重要的调控作用，而糖酵解是肿瘤细胞获得能力的重要方式，故其表达异常与肿瘤的发生发展密切相关[1]。研究[2-4]显示，MCT1在透明细胞肾癌、乳腺癌和肝癌等肿瘤中呈现异常高表达，且可通过调控细胞增殖、转移和凋亡等发挥着重要的致癌作用。近年来，有研究[5]指出，MCT1在宫颈癌组织中表达上调，且其表达水平的改变与宫颈癌病情进展密切相关；但MCT1在宫颈癌发生发展中的作用并不清楚。本研究通过靶向干扰宫颈癌Hela细胞中MCT1表达，观察下调MCT1表达对Hela细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其可能的分子机制，旨在为宫颈癌的发病机制及治疗提供新线索。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器 人宫颈癌细胞株Hela(美国ATCC)，Lipofectamine TM2000(美国Invitrogen)，噻唑蓝(methyl thiazolyl tetrazolium, MTT)、二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)和胎牛血清(美国Sigma)，Dulbecco′s modified eagle medium(DMEM培养基)、胰蛋白酶(美国Gibco)，MCT1-siRNA及其阴性对照(上海吉玛)，聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(美国Roche)，β肌动蛋白(β-actin)抗体、MCT1抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体和HRP标记的二抗(美国Santa Cruz)，RIPA裂解液、细胞周期检测试剂盒(上海碧云天)，BCA蛋白定量试剂盒和ECL发光试剂盒(美国Piece)，细胞凋亡检测试剂盒(美国BD)，流式细胞仪(德国美天旎)，凝胶成像系统(意大利Bio-Rad)，酶标仪(美国Biotech)，恒温细胞培养箱(上海一恒)。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养、分组与转染 采用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基在条件为5% CO2、湿度饱和的37 ℃恒温培养箱中常规培养宫颈癌Hela细胞。实验分为未转染组(正常培养)、阴性对照组(转染阴性对照)和MCT1-siRNA组(转染MCT1-siRNA)。将对数生长期的Hela细胞按照106个/孔接种至6孔细胞板上后，置于恒温培养箱中常规培养；待细胞融合度达70%左右时，参照转染试剂Lipofectamine TM2000说明书将MCT1-siRNA及其阴性对照分别转染至Hela细胞中。转染5 h后，更换新鲜培养基；继续培养48 h后，胰蛋白酶消化收集各组细胞进行后续实验。
1.2.2 Western blot检测Hela细胞中MCT1、Bcl-2和Bax蛋白表达 向Hela细胞中加入RIPA裂解液抽提细胞总蛋白，采用BCA法检测总蛋白的浓度与纯度；将蛋白样品与上样缓冲液按照1∶1比例混匀，置于沸水中煮沸5 min使蛋白变性。将变性后的蛋白样品按照每孔50 μg行SDS-PAGE凝胶电泳分离，转至PVDF膜上。经5%脱脂奶粉封膜2 h，加入以1∶1 000比例稀释的MCT1、Bcl-2、Bax和β-actin抗体；置于4 ℃下孵育24 h，加入以1∶2 000比例稀释的HRP标记的二抗；室温孵育2 h，参照ECL试剂盒说明书加入ECL发光剂；暗室内显影曝光，以β-actin为内参，采用凝胶成像分析系统扫描分析Hela细胞中MCT1、Bcl-2和Bax蛋白表达水平。
1.2.3 MTT法检测Hela细胞增殖 将对数生长期的Hela细胞按照105个/孔种植到96孔细胞板上后，置于恒温细胞培养箱中常规培养过夜。按照1.2.1中分组同步化处理，其中每组设置3个复孔。待转染48 h后，弃培养基并以磷酸盐缓冲液洗涤细胞2次；向每孔中加入20 μL 5 g/L MTT试剂孵育4 h后，每孔加入150 μL DMSO摇床震荡反应15 min。采用酶标仪在490 nm波长处检测各组Hela细胞的OD值。实验重复3次。
1.2.4 流式细胞仪检测Hela细胞周期和凋亡 将对数生长期的Hela细胞按照106/孔种植到12孔细胞板上后，置于恒温细胞培养箱中常规培养。按照1.2.1中的分组方法处理Hela细胞，其中每组设置3个复孔。收集转染48 h后的阴性对照组、MCT1-siRNA组和未转染组细胞，经预冷的磷酸盐缓冲液洗涤2次后，分别参照细胞周期检测试剂盒和细胞凋亡检测试剂盒说明书步骤检测各组Hela细胞周期分布情况及凋亡率。实验均重复3次。
1.3 统计学方法 应用SPSS 22.0统计学软件分析数据。计量资料多组间比较使用F检验、SNK-q检验和重复测量方差法分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 下调MCT1表达对宫颈癌Hela细胞增殖的影响 Western blot检测结果显示，阴性对照组Hela细胞中MCT1蛋白表达水平与未转染组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但MCT1-siRNA组Hela细胞中MCT1蛋白表达水平较未转染组明显降低(P<0.05)；MTT实验结果结果显示，与未转染组比较，阴性对照组Hela细胞增殖活力差异无统计学意义(P>0.05)，但MCT1-siRNA组Hela细胞增殖活力明显减弱(P<0.05)。细胞增殖活力/OD490nm值在不同组间、时点间、组间·时点间差异均有统计学意义(P值均<0.01)，见图1，表1，2。
图1 Western blot检测各组细胞中MCT1蛋白表达电泳图
Figure 1 Electrophoresis of MCT1 protein expression in each group detected by Western blot
表1 各组细胞中MCT1蛋白表达水平的比较
Table 1 Comparison of MCT1 protein expression levels in cells
组别 MCT1蛋白表达水平未转染组 0.76±0.06 阴性对照组 0.73±0.05 MCT1-siRNA组0.15±0.02*F值 491.123P值 <0.001
*P值<0.05与未转染组比较(SNK-q检验)
表2 各组细胞中细胞增殖活力的比较
Table 2 Comparison of cell proliferation activity among cells in each group
组别细胞增殖活力/OD490nm值24 h48 h72 h未转染组0.26±0.030.52±0.040.86±0.06阴性对照组0.25±0.030.55±0.040.83±0.05MCT1-siRNA组0.28±0.030.31±0.030.48±0.03组间F值=72.859 P值<0.001时点间F值=27.137 P值<0.001组间·时点间F值=44.553 P值<0.001
2.2 下调MCT1表达对宫颈癌Hela细胞周期的影响 流式细胞仪检测结果显示，与未转染组比较，阴性对照组Hela细胞在不同时相所占百分比差异均无统计学意义(P>0.05)，但MCT1-siRNA组Hela细胞在G0/G1期所占百分比明显升高，而在S期所占百分比明显降低(P<0.05)。见表3。
表3 各组细胞在不同时相所占百分比和细胞凋亡率的比较
Table 3 Comparison of the percentage of cells in different groups and the rate of cell apoptosis
组别细胞周期(%)G0/G1SG2/M细胞凋亡率(%)未转染组43.38±3.1528.50±2.2628.05±2.036.12±1.05阴性对照组45.65±3.3726.48±1.7527.87±1.327.25±1.48MCT1-siRNA组54.18±4.23*18.36±1.51*27.46±1.1818.86±3.12*F值22.35074.4250.340103.068P值<0.001<0.0010.715<0.001
*P值<0.05与未转染组比较(SNK-q检验)
2.3 下调MCT1表达对宫颈癌Hela细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示，与未转染组比较，阴性对照组Hela细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05)，但MCT1-siRNA组Hela细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。见图2。
图2 流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况
Figure 2 Flow cytometry detection of cell apoptosis in each group
2.4 下调MCT1表达对宫颈癌Hela细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达的影响 Western blot检测结果显示，与未转染组比较，阴性对照组Hela细胞中Bcl-2和Bax蛋白的表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)，但MCT1-siRNA组细胞中Bcl-2蛋白表达水平明显降低，而Bax蛋白表达水平明显升高(P<0.05)。见图3和表4。
图3 Western blot检测各组细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达电泳图
Figure 3 Electrophoresis of Bcl-2 and Bax protein expression in cells of each group detected by Western blot
表4 各组细胞中Bcl-2和Bax蛋白表达水平的比较
Table 4 Comparison of Bcl-2 and Bax protein expression levels in each group of cells
组别Bcl-2Bax未转染组0.87±0.050.24±0.03阴性对照组0.83±0.060.26±0.03MCT1-siRNA组0.41±0.03*0.68±0.04* F值250.457490.235 P值<0.001<0.001
*P<0.05与未转染组比较(SNK-q检验)
3 讨 论
宫颈癌是妇科恶性肿瘤，在全球妇女恶性肿瘤中位居第4[6-7]。我国每年有超过13万人被确诊为宫颈癌，有超过2万人因其死亡[8]，且我国年轻女性宫颈癌病死率正以惊人的速度上升[9]。2018年5月，世界卫生组织总干事呼吁全球采取行动将宫颈癌作为一个公共卫生问题加以消除[10]，而在开始消除宫颈癌之前，需要开展大量的工作，而深入了解宫颈癌的发病机制是该工作中必不可少的内容。宫颈癌的发生发展是一个涉及多种基因功能失调的复杂过程，探讨宫颈癌中异常表达基因在宫颈癌中的作用对了解宫颈癌的发病机制及分子靶点治疗具有重要意义。本研究证实，在宫颈癌细胞中下调MCT1表达对细胞增殖具有显著抑制作用，并对其凋亡表现出促进作用，表明，MCT1可能成为宫颈癌的生物标志物和有希望的治疗靶标。值得注意的，MCT1在宫颈癌中的生物学功能与细胞周期和Bax、Bcl-2蛋白表达密切相关，为宫颈癌分子机制的进一步研究提供了新的启示。
有氧糖酵解是肿瘤细胞代谢的重要方式[11-13]，而细胞内代谢产生的乳酸是依赖于MCT1的转运；MCT1是一种跨膜蛋白，在乳酸转运及代谢过程中发挥着重要作用[1]。MCT1被发现在许多不同类型的癌症过度表达，其异常表达与肿瘤发生发展密切相关[14]。例如：MCT1的高表达与透明细胞肾癌患者总体生存期降低和无进展生存期显著相关，是患者或接受靶向治疗患者的预后生物标志物[15]。Zhang等[16]研究发现，在膀胱癌中MCT1表达上调，且MCT1高表达与患者总生存期短和淋巴结转移等密切相关；而下调MCT1表达可通过降低细胞乳酸水平、GLUT1和HK2等表达抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和迁移。王仲崑等[17]研究发现，以MCT1抑制剂抑制MCT1活性可上调促凋亡蛋白Bax，并下调抑凋亡蛋白Bcl-2表达，抑制胃癌细胞增殖并诱导细胞凋亡。Wu等[18]研究显示，MCT1在胰腺癌中高表达，抑制MCT1能够抑制胰腺癌细胞的增殖和迁移能力，并降低肿瘤形成的效率，以及增加凋亡细胞的数量。上述结果证明了，MCT1在多种肿瘤中作为癌基因，有助于癌症的病理演进过程。胡媛等[5]报道指出，MCT1在宫颈癌中呈现高表达，但其在宫颈癌发生发展中的作用并不清楚。因此，本研究通过靶向干扰宫颈癌Hela细胞中MCT1的表达，以探究其在宫颈癌细胞增殖和凋亡中的生物学功能及潜在机制。
本实验中，Western blot检测转染MCT1-siRNA后宫颈癌Hela细胞中MCT1的表达，结果显示，MCT1-siRNA组Hela细胞中MCT1蛋白表达水平较未转染组明显降低，说明转染MCT1-siRNA成功下调MCT1在Hela细胞中的表达。MTT法检测发现，下调MCT1表达导致宫颈癌Hela细胞增殖活力明显减弱。结果表明，下调MCT1表达可抑制宫颈癌Hela细胞增殖。同时，本研究还发现MCT1低表达的Hela细胞在G0/G1所占百分比明显升高，而在S期所占百分比明显降低。结果提示，下调MCT1表达可通过诱导细胞周期阻滞发挥抑制宫颈癌细胞增殖的作用。另外，本研究还发现MCT1低表达的Hela细胞凋亡率明显升高。表明下调MCT1表达可诱导宫颈癌Hela细胞凋亡。这与王仲崑等[17]的报道一致。同时，进一步检测凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达情况发现，下调MCT1表达可使宫颈癌Hela细胞中Bcl-2蛋白表达水平降低，而Bax蛋白表达水平升高。结果表明，下调MCT1表达可通过上调Bax和下调Bcl-2表达诱导宫颈癌细胞凋亡。这提示，在宫颈癌发生发展过程中MCT1可通过影响细胞增殖和凋亡发挥着重要的致癌作用。
综上所述，下调MCT1表达可通过抑制宫颈癌Hela细胞增殖并促进其凋亡，其作用机制可能与诱导细胞周期阻滞和调控Bax、Bcl-2蛋白表达有关。本研究结果表明，MCT1基因在宫颈癌细胞的增殖和凋亡过程中发挥重要作用，为宫颈癌的分子靶向治疗提供了新的靶点。
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