心血管疾病已经成为威胁人类健康最主要的因素。心血管疾病死亡占全球致死因素的1/3[1]。因此，研究心血管疾病的发病机制和治疗策略尤为重要。心肌肥厚是多种心血管疾病共有的发病基础[2]。因此，研究心肌肥厚的生物学过程和机制有助于研发治疗心力衰竭等重大心血管疾病的治疗策略。包含HECT和RLD结构域的E3连接酶2(HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase 2，HERC2)是一种E3泛素连接酶。HERC2协调受损染色体上脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid,DNA)修复因子的泛素依赖性组装。HERC2穿梭于细胞核和细胞质之间，它的C端HECT结构域与乳腺癌易感基因1号(breast cancer susceptibility gene 1,BRCA1)中的N端相互作用，诱导BRCA1的程序性降解。在本研究主要探讨了E3泛素连接酶HERC2在心肌肥厚中的作用。
1 材料与方法
1.1 实验材料 心肌组织收集于河北医科大学第二医院心脏大血管外科，肥厚心肌组织取自主动脉瓣狭窄患者，对照组心肌组织收集取自房间隔缺损患者。本研究临床样本采集与大鼠动物实验均通过了河北医科大学伦理委员会审批。所有患者均单独签署了知情同意书。所有实验步骤均按照规定章程进行。SD大鼠及乳鼠购自北京维通利华生物科技有限公司。细胞改良伊格尔培养基(Dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)培养基、胎牛血清、抗生素购自ThermoFisher公司。siRNA及细胞转染试剂RNAiMAX购自Invitrogen公司。细胞裂解液RIPA试剂购自碧云天生物科技有限公司。核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)提取相关试剂、RNA逆转录试剂盒和实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR)试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ)购自Sigma公司。甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、HERC2、磷脂肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、p-PI3K、AKT丝氨酸-苏氨酸激酶(AKT serine/threonine kinase，AKT)、p-AKT抗体购自Abcam公司。辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)偶联二抗购自中杉金桥公司。电致化学发光液(electrogenerated chemiluminescence，ECL)购自碧云天生物科技有限公司。磷酸盐缓冲液(phosphate buffer, PBS)购自Gibco公司。缓释泵购自ALZET公司。
1.2 方法
1.2.1 大鼠心肌肥厚模型 成年SD大鼠经气体麻醉后，在其背部用手术剪刀剪开一个小口，在皮下植入缓释泵，缓释Ang Ⅱ，缓释剂量为1.5 mg·kg-1·d-1，实验周期为4周。
1.2.2 大鼠原代心肌细胞分选与培养 用1～3 d SD乳鼠取心肌细胞。SD乳鼠经酒精消毒后剪开胸腔，取出心室组织用预冷PBS洗净，然后将心室组织剪碎至乳糜状，加入胰酶消化至单细胞悬液，加入等体积含血清的培养基终止消化。随后，1 500 r/min离心5 min去上清后将细胞用培养基重悬后，在细胞培养箱预培养2 h。此时，成纤维细胞已经贴壁，可以将上清中心肌细胞转移至新的培养皿中培养待用。培养条件为DMEM加入10%胎牛血清，1%抗生素，37 ℃培养。
1.2.3 siRNA介导基因沉默 将对照siRNA和siHERC2(5′-GAGCTTTGCGTGGTCATCTT-GTTCT-3′)转染进心肌细胞，沉默心肌细胞中HERC2表达。转染用RNAiMAX转染试剂盒进行，转染方法按照说明书推荐比例进行转染。
1.2.4 心肌细胞肥大模型 新分选的细胞培养48 h后，换成无血清培养基培养24 h，随后用Ang Ⅱ (1 μmol/L)刺激48 h诱导心肌细胞肥大。
1.3 Western blot 将新鲜组织或心肌细胞用放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay，RIPA)裂解液裂解后加入上样缓冲液。取30 μg蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)电泳，随后将蛋白质转印到聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PDVF)膜上，将膜用洗膜缓冲液(tris buffered saline twee，TBST)洗2遍后，5%脱脂牛奶室温封闭抗原1 h。用TBST洗 2遍膜，一抗4 ℃孵育过夜。第2天，取出膜后用TBST将其洗2遍，二抗室温孵育2 h。随后用TBST洗净膜，用电致化学发光(electrogenerated chemiluminescence，ECL)显影分析蛋白表达水平。
1.4 qRT-PCR 将心肌组织或心肌细胞裂解后，用氯仿-异丙醇法提取新鲜组织总RNA。随后用RNA逆转录试剂盒对1 μg总RNA进行逆转录获得cDNA。最后用qRT-PCR试剂盒分析目的基因表达水平。引物序列见表1。
表1 qRT-PCR引物
Table 1 qRT-PCR primer
基因名上游引物(5′-3′)下游引物(5′-3′)人HERC2GCGCTGTCTTTTGCCTTTGAGGAACCTGGTCGCTCTCTC人GAPDHTGGACTCTGTTCGCTCAGGTTGCCTCCTTCCGTACCACAT人ANPGATGGTGACTTCCTCGCCTCAAGAAAGCACACCAACGCAG人BNPTGGAAACGTCCGGGTTACAGCTGATCCGGTCCATCTTCCT人MYH7AGTGGCAATAAAAGGGGTAGCCCAAGTTCACTCACATCCATCA大鼠HERC2ATCCAGCTTGCATTCACAAGATGACTTGGCTCTATACACAGGTG大鼠GAPDHCAACTATGTGGGGGACTCGGTGGCTCTGGGCACATACTTG大鼠ANPCCTGGACTGGGGAAGTCAACATCTATCGGAGGGGTCCCAG大鼠BNPTGACGGGCTGAGGTTGTTTTACACTGTGGCAAGTTTGTGC大鼠MYH7CCCAACCCTAAGGATGCCTGTGTGTTTCTGCCTAAGGTGCT
1.5 统计学方法 应用GraphPad Prism 8统计软件分析数据。计量资料比较采用独立样本的t检验、单因素方差分析和Turkey检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 HERC2在心肌肥厚患者中表达增加 结果显示，心肌肥厚肥厚标志基因心房利钠肽(natriuretic peptide A，ANP)(t=13.120,P<0.01)、脑钠肽(natriuretic peptide B，BNP)、肌球蛋白重链7(myosin heavy chain 7，MYH7)和HERC2 mRNA表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表2。
表2 心肌肥厚患者心肌组织中肥厚标志基因和HERC2基因表达水平
Table 2 The expression of hypertrophic fetal marker genes and HERC2 in myocardial tissues from patients and control donors
组别基因相对表达量ANPBNPMYH7HERC2对照组 1.00±0.111.00±0.121.00±0.161.00±0.13心肌肥厚组7.24±1.7412.10±2.1815.64±1.755.14±1.41t值 13.12020.68022.40013.590P值 <0.001<0.001<0.001<0.001
2.2 HERC2在心肌肥厚大鼠中表达增加 Ang Ⅱ组ANP、BNP、MYH7和HERC2 mRNA表达水平显著高于对照组，差异有统计学意义(P<0.01)，见表3。
表3 大鼠肥厚心肌组织中肥厚标志基因和HERC2表达水平
Table 3 Expression of hypertrophic fetal marker genes and HERC2 in myocardial tissues from control rats and rats infused with angiotensin Ⅱ
组别 基因相对表达量ANPBNPMYH7HERC2对照组1.00±0.121.00±0.111.00±0.121.00±0.10AngⅡ组3.37±1.123.71±1.294.12±1.513.18±1.20t值10.1908.7009.4508.740P值<0.001<0.001<0.001<0.001
2.3 在心肌细胞中用siRNA方法沉默HERC2基因 与干扰对照组(si-NC)比较，HERC2干扰组(si-HERC2)中HERC2的mRNA和蛋白水平显著下降，见图1、表4。
图1 Western blot检测siRNA敲低HERC2的表达
Figure 1 siRNA-mediated knockdown of HERC2 by western bloting
2.4 HERC2敲低抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大 与PBS si-NC组比较，Ang Ⅱ si-NC组的细胞心肌细胞面积显著增大(P<0.01)，并且Ang Ⅱ si-NC组心肌肥厚标志基因ANP(P<0.01)、BNP和MYH7(P<0.01)的表达显著上调。和Ang Ⅱ si-NC组相比，Ang Ⅱ si-HERC2组的心肌细胞面积显著减小(P<0.01)，并且心肌肥厚标志基因ANP、BNP和MYH7(P<0.01)的表达显著下调。见表5。
2.5 敲低HERC2抑制Ang Ⅱ诱导的PI3K-AKT信号的激活 PI3K-AKT信号的激活是促进心肌肥厚的重要细胞内信号之一，抑制PI3K-AKT信号可以抑制心肌肥厚的发生发展和心力衰竭的发生。Ang Ⅱ可以显著地激活PI3K-AKT信号通路，敲低HERC2可以显著的抑制 PI3K-AKT信号活性。见图2。
表4 siRNA敲低HERC2的mRNA表达
Table 4 siRNA-mediated knockdown of HERC2 mRNA level in cardiomyocytes
组别HERC2相对表达量干扰对照组 1.00±0.12HERC2干扰组0.18±0.04t值13.190P值<0.001
表5 敲低HERC2表达抑制Ang Ⅱ诱导的心肌细胞肥大
Table 5 Knockdown of HERC2 expression inhibited Ang Ⅱ-induced cardiac myocyte hypertrophy
组别心肌细胞面积(μm2)ANP表达BNP表达MYH7表达PBSSi-NC组1894±1021.00±0.101.00±0.111.00±0.09PBSSi-HERC2组1941±1540.98±0.141.10±0.131.05±0.11AngⅡSi-NC组3214±197∗3.41±0.31∗3.12±0.21∗3.78±0.19∗AngⅡSi-HERC2组2145±142#1.64±0.15#1.64±0.15#1.78±0.19#F值348.10054.29081.030182.400P值<0.001<0.001<0.001<0.001
*P值<0.05与PBS Si-NC组比较 #P值<0.05与Ang Ⅱ Si-NC组比较(Turkey检验)
图2 敲低HERC2表达抑制Ang Ⅱ对PI3K-AKT信号的激活作用
Figure 2 Knockdown of HERC2 inhibits Ang Ⅱ-induced activation of PI3K-AKT signaling
3 讨 论
心肌肥厚分为病理型心肌肥厚和生理型心肌肥厚。妊娠可以诱发生理型肥厚，这种类型的心肌肥厚具有可逆性。高血压、心肌梗死和神经内分泌等病理性刺激可以诱发病理型心肌肥厚。这种类型的心肌肥厚具有不可逆性[3]。持续的病理性刺激导致长期的心肌肥厚，并可能最终导致心肌纤维化、心律不齐和心力衰竭[4]。本研究探讨了E3泛素连接酶HERC2在人和大鼠心肌肥厚中的功能和机制。发现HERC2在人和大鼠心肌肥厚过程中高表达。本研究表明HERC2促进Ang Ⅱ诱导的心肌肥厚肥大和心肌肥厚标志基因的表达。机制研究表明HERC2可以抑制Ang Ⅱ对PI3K-AKT信号通路的激活作用。
蛋白质的泛素化修饰对蛋白质稳定性起着非常重要的调控作用[5]。以往的研究表明泛素化酶和去泛素化酶通过对特定靶蛋白进行修饰，从而在心肌肥厚过程中扮演者重要的角色[6]。HERC2是一种E3泛素连接酶[7]。但是，HERC2在心血管疾病中的功能尚不清楚。HERC2促进BLM和WRN解旋酶复合物与RPA相互作用，抑制g-四重态DNA[8]。此外，HERC2泛素连接酶对胚胎发育和调节运动协调至关重要[9]。但是，HERC2在心血管疾病中的功能尚不清楚。
为了研究HERC2在心血管疾病中的潜在功能，本研究首先分析了HERC2在患者心肌肥厚和大鼠心肌肥厚心肌组织中的表达谱变化，包括5例心肌肥厚患者和5例对照者的心肌组织，检测了心肌肥厚标志基因和HERC2的表达水平，发现了HERC2在心肌肥厚组织中呈现高表达。随后也在大鼠中用Ang Ⅱ诱导了大鼠心肌肥厚。同样，分析了心肌肥厚标志基因和HERC2的表达水平，发现HERC2表达水平在大鼠心肌肥厚组织中同样呈现出高表达。表明HERC2在心肌肥厚组织中高表达具有物种保守性，暗示着HERC2在心肌肥厚中起着一定的调控作用。
为了进一步明确HERC2在心肌肥厚中的功能，在体外构建了心肌细胞肥大模型。利用siRNA在心肌细胞中敲低了HERC2的表达，随后用Ang Ⅱ诱导了心肌肥厚。Ang Ⅱ刺激可以增大心肌细胞大小，促进心肌肥厚标志基因的表达，但是当HERC2被敲低以后，Ang Ⅱ诱导心肌肥厚的效应被明显剥夺。研究结果证明HERC2在Ang Ⅱ诱导心肌肥厚过程中具有关键的调节作用，也提示HERC2可以作为治疗心肌肥厚的潜在靶点。但是，还需要后续的研究证明HERC2是否在动物水平调节心肌肥厚。最后，探讨了HERC2促进心肌肥厚的分子机制。心肌肥厚的发生和发展受到众多细胞外和细胞内信号的协同调控。心肌肥厚的发生是促心肌肥厚因素和抑制心肌肥厚因素不平衡引起[10]。在心肌肥厚过程中，细胞中多个信号节点被持续激活，这包括蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)信号、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号、蛋白激酶(protein kinase C，PKC)信号、PI3K-AKT信号等[11-12]。例如，细胞外生长因子和神经分泌因子可以激活胞内PI3K信号，PI3K信号可以磷酸化并激活AKT，AKT蛋白进一步通过糖原合酶激酶3β(Glycogen synthase kinase-3 beta，GSK3b)等调控心肌肥厚相关转录因子的转录活性，启动心肌肥厚标志基因的表达。这些标志基因包括ANP、BNP和MYH7等[11]。PI3K-AKT信号在心肌肥厚过程中起着关键的调控作用[13-14]。多种病理刺激，如高血压、心肌梗死和神经内分泌因素等，都可以激活PI3K-AKT信号通路，进而诱导心肌肥厚的发生[15]。但是PI3K-AKT如何被控制尚不完全清楚。本研究结果显示，Ang Ⅱ可以激活PI3K-AKT的信号通路。但是，当HERC2被敲低以后，Ang Ⅱ不能够明显的激活PI3K-AKT信号。这些实验结果表明，在心肌肥厚过程中，PI3K-AKT信号通路受到HERC2的调控作用，而PI3K-AKT也是HERC2促进心肌肥厚的关键分子机制之一。
综上所述，HERC2是一种保守的调控心肌肥厚的E3连接酶，HERC2可以通过调控PI3K-AKT信号通路的活性进而促进心肌肥厚。因此，HERC2可能作为将来治疗心肌肥厚的潜在靶点之一。
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