我国为全球结核病高负担国家之一,其中肺外结核病疫情严峻,而骨关节结核是危害较大的肺外结核病,其临床表现复杂。目前临床骨关节结核的早期诊断不容乐观,相关文献报道骨关节结核的误诊率高达78.26%。这与医师对该病的认知度低有关，同时也与骨关节结核临床症状缺乏特异度、获得细菌学及病理学困难、影像学检查存在局限性等原因有关[1]。利福平耐药荧光定量核酸扩增检测(Xpert Mtb/RIF)是近年来研发的一种快速、有效的分子生物学诊断技术。目前国内外已将其应用于骨关节结核的诊断，具有较高的敏感度和特异度[2-3]。然而该技术在利福平耐药和结核分枝杆菌培养检测中只有平均敏感度[4]。标本的类型是否会影响检测的准确性尚无定论。为探讨不同标本类型对Xpert MTB/RIF检测结果的影响，本研究观察骨关节结核患者病灶中脓液、干酪组织、肉芽组织、骨组织检测的阳性率，为术中选择标本提供依据，以提高骨关节结核的诊断水平。
1 资料与方法
1.1 标本收集 选取2016年6月—2019年6月在河北省胸科医院骨科接受手术治疗，且经“临床诊断标准”最终确诊的骨关节结核患者245例，男性108 例，女性137例；年龄34～77岁，平均(52.2±12.2)岁。病灶部位：颈椎结核15例，胸椎结核42例，腰椎结核52例，骶椎结核21例，髋关节结核27 例，膝关节结核例38例，腕关节结核15例，手指结核8例，胸骨结核15例，骨盆结核 12例。所有患者均接受手术治疗，术中收集脓液标本199份、干酪样组织标本161份、肉芽组织标本178份、骨组织标本87份。其中有41例患者同时获取了4种标本。所有标本分别进行结核分枝杆菌培养、药物敏感试验和Xpert MTB /RIF技术检测。
1.2 标本处理 依照《结核病诊断实验室检验规程》[5] ，将所有组织标本彻底研磨，用N-乙酰-L-半胱氨酸-氢氧化钠适当清洗，3 000 r/min 离心20 min。干酪坏死组织、肉芽组织、骨组织加入适量磷酸盐缓冲液后，应用微型研磨器(Fast-prep24美国MP Biomedicals 公司)研磨，按组织的坚韧度等调节设置按钮，采用频率为6.5 m/L，设置时间标准为 20 s，振荡2～3次形成匀浆，制成悬液，接种用。将标本沉淀物均匀分为2个部分，分别用于结核分枝杆菌培养及药物敏感试验和Xpert MTB/RIF系统检测。
1.3 结核分枝杆菌检测 将标本送至结核菌室行菌种鉴定及药物敏感试验，用MGIT960自动结核分枝杆菌培养仪(美国 BD公司生产)进行培养，培养阳性的样本进一步以最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)法 进行结核药物敏感试验。操作步骤参照《结核病诊断细菌学检验规程》[5]，具体药物浓度检测的上下限：乙胺丁醇(2.5～20 mg/L)、 克拉霉素(2.5～16 mg/L)、 异烟肼(0.2～1.6 mg/L)、利福平(1～8 mg/L)、链霉素(1～8 mg/L)、盐酸左氧氟沙星(2～8 mg/L)、对氨基水杨酸异烟肼(0.1～1 mg/L)、丙硫异烟胺(10～40 mg/L)、阿米卡星(1～4 mg/L)、卷曲霉素(2.5～10 mg/L)、莫西沙星(0.5～2 mg/L)、利福布丁(0.75～3 mg/L)、环丙沙星(1～10 mg/L)、利福喷丁(0.75～3 mg/L)、克拉霉素(15～25 mg/L)、对氨基水杨酸(2～8 mg/L)、氯法齐明(2～8 mg/L)、利福喷丁(0.5～2 mg/L)。
1.4 Xpert MTB/RIF 检测 将标本同时送分子生物学试验室行 Xpert MTB/RIF 检测(美国Cepheid公司)。根据Xpert MTB/RIF应用手册，将各冰冻病灶标本解冻后，各取1 mL标本沉淀物加入2 mL样本处理液，剧烈震荡20次，室温孵育10 min；再次振荡，室温孵育5 min，使用新的移液管，将2 mL样本加入试剂匣，将标本置4通道Gene Xpert平台进行自动操作，约2 h后将样品加入盒子，系统可以自动读取测试结果和利福平耐药结果。
1.5 临床诊断标准 英国国家卫生医疗质量标准署于2011年制定的结核病诊疗与防控指南中“骨结核临床诊断标准”[6]：①结核分枝杆菌培养阳性；②病理结果回报结核性肉芽肿，干酪样坏死；③影像学表现典型骨结核；④抗结核药物治疗有效。上述任何一项符合即临床诊断为“骨结核”。
1.6 统计学方法 应用SPSS 17.0统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2 检验。以结核分枝杆菌培养及药物敏感试验为金标准，计算Xpert MTB/RIF检测的敏感度和特异度。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 结核分枝杆菌培养和Xpert MTB/RIF检测阳性率比较 245例患者中结核分枝杆菌培养阳性112例，阳性率为45.71%。625份标本中结核分枝杆菌培养阳性213份，结核分枝杆菌培养阳性率比较脓液>干酪组织>肉芽坏死组织>骨组织，差异有统计学意义(P<0.01)。245例患者中Xpert MTB/RIF检测阳性128例，阳性率为52.24%。625份标本中Xpert MTB/RIF检测阳性255份，Xpert MTB/RIF检测阳性率比较脓液>干酪组织>肉芽组织>骨组织，差异有统计学意义(P<0.01)。2种方法联合检测阳性185例，阳性率为75.51%。Xpert MTB/RIF检测技术检验脓液、肉芽组织、干酪组织、骨组织阳性率均高于结核分枝杆菌培养，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表1。
表1 2种检测方法及不同标本阳性率比较
Table 1 Comparison of two detection methods and positive rates of different specimens (例数，%)
标本标本数结核分枝杆菌培养XpertMTB/RIF检测χ2值P值多标本 245112(45.71)128(52.24)26.133<0.001脓液 19981(40.70)94(47.23)5.4600.019干酪组织16156(34.78)65(40.37)4.1800.041肉芽组织17855(30.89)66(37.07)5.4220.020骨组织 8721(24.14)30(34.48)16.297<0.001χ2值16.49629.343P值<0.001<0.001
2.2 Xpert MTB/RIF检测诊断骨关节结核的敏感度和特异度 Xpert MTB/RIF技术检测诊断骨关节结核的敏感度为96.43%，特异度为84.96%。见表2。
表2 Xpert MTB/RIF检测诊断骨关节结核的敏感度和特异度
Table 2 Sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF assay (例数)
XpertMTB/RIF检测结核分枝杆菌培养阳性阴性合计阳性 10820128阴性 4113127合计 112133245敏感度96.43%特异度84.96%准确度90.20%
2.3 Xpert MTB/RIF检测诊断利福平耐药的敏感度和特异度 112例培养阳性患者中Xpert MTB/RIF技术检测诊断利福平耐药的敏感度为97.92%，特异度为93.75%。见表3。
表3 Xpert MTB/RIF检测利福平耐药的敏感度及特异度
Table 3 Sensitivity and specificity of Xpert MTB/RIF for detecting rifampicin resistance (例数)
XpertMTB/RIF检测利福平耐药药物敏感试验利福平耐药阳性阴性合计阳性 47451阴性 16061合计 4864112敏感度97.92%特异度93.75%准确度95.53%
3 讨 论
抗结核药物在治疗骨关节结核病的过程中起着至关重要的作用。随着全球耐药结核病例数逐渐增多，特别是多重耐药及广泛耐药结核分枝杆菌的出现，骨关节结核的治疗正面临巨大挑战[7]。早期诊断并进行药物敏感试验指导下的个体化治疗是治疗耐药结核的关键，否则可能导致获得性耐药以致需要更长时间的治疗周期。目前常规结核分枝杆菌培养及药物敏感试验通常需要几周至数月时间才能完成结核分枝杆菌培养及药物敏感试验，且阳性率从10%～60%不等[8]。在此期间，经验性抗结核化疗可能会导致获得性耐药。迫切需要开展快速、准确、高效率的方法用于骨关节结核诊断及耐药性检测。骨关节结核的诊断包括影像学检测、病理学检测和病原微生物学检测，且长期以来骨关节结核的结核分枝杆菌培养阳性率较低[9]。
目前基于分子生物学PCR技术的Xpert MTB/RIF分子诊断技术是一种快速、有效的诊断结核感染的方法。Xpert MTB/RIF技术是通过整合核酸准备、扩增、实时监测的完全自动化检测结核分枝杆菌和利福平耐药技术[10]。其最大程度简化结核分枝杆菌检测，且不受非结核分枝杆菌影响，将结核分枝杆菌液体培养系统至少3周才能完成的培养及利福平耐药检测缩短为2 h，操作简单、结果可靠，对操作者和周围环境安全，在肺结核痰标本结核分枝杆菌检测中敏感度为95.8%，特异度为98.4%，检测利福平耐药的敏感度为93.33%，特异度为94.12%[6]。目前该技术已经用于骨关节结核检测，但是目前国内外学者发现其对结核分枝杆菌检测的特异度较高，敏感度一般，标本类型及处理会影响其检测结果阳性率呢？目前，关于不同类型组织标本的检测差异的研究和报告缺乏[11]。
为探讨如何选择标本类型，以提高该技术的阳性率，本研究发现联合不同类型标本(包括脓液、肉芽组织、干酪组织、骨组织中1种或以上标本)，结核分枝杆菌培养阳性率为45.71%，Xpert MTB/RIF检测阳性率为52.24%，联合检测为阳性率75.51%。有研究表明，临床医生在骨关节结核手术中，应尽量留取多种标本并在条件允许情况下开展联合检测，有利于提高总体阳性率，将对骨关节结核的诊断大有裨益，对缩短诊断时间亦有积极意义[12]。在脓液、肉芽组织、干酪组织、骨组织标本中，Xpert MTB/RIF技术检测的阳性率均高于结核分枝杆菌培养，表明Xpert MTB/RIF技术检测比结核分枝杆菌培养更适用于骨关节结核患者的标本检测。以结核分枝杆菌培养和药物敏感试验为金标准，Xpert MTB/RIF检测诊断骨关节结核的敏感度为96.43%，特异度为84.96%，诊断利福平耐药的敏感度为97.92%，特异度为93.75%。因骨关节结核手术中病灶标本取材质地不同、含菌量不同、前期处理方式不同，分子诊断技术的阳性率与不同类型标本的质地及含菌量相关，为进一步提高早期诊断的阳性率，有必要对病灶内不同类型组织标本结核分枝杆菌检测阳性率进行比较[13]。 本研究结果显示，无论是Xpert MTB/RIF检测还是结核分枝杆菌培养，阳性率均为脓液>肉芽组织>干酪组织>骨组织，表明早期在超声或CT引导下穿刺脓肿，进行脓液结核分枝杆菌检测可获得阳性发现。不同类型的标本进行Xpert MTB/RIF检测和结核分枝杆菌培养，可确定结核感染和评估其耐药性，进行有效治疗[14]。病灶中尽量取多种类型标本，进行Xpert MTB/RIF及结核分枝杆菌培养联合检测，可明确结核分枝杆菌感染并且评估其耐药性，早期开展有效的抗结核化疗。
各种标本检测阳性率差异的原因为：骨关节结核病变发展早期，由于菌量多，机体处于较强变态反应期，组织器官中血管的渗透性较高，炎性介质及蛋白质向血管外渗出，此时处于以渗出为主的脓液性病理表现，主要表现为浆液性、纤维蛋白炎性渗出，经过渗出、坏死、增生变化逐渐形成结核性肉芽组织及干酪坏死物，干酪物质软化，最后液化形成结核性脓肿。在病理过程的不同阶段，结核分枝杆菌浓度分布情况不同[15-17]。应收集不同类型的脊柱结核标本，特别是脓液，采用Xpert MTB/RIF测定以提高诊断率。随着耐药结核病患者数量增加有必要改变现有的检测系统，扩大基因检测的覆盖范围，以开展完整的评估。
传统结核分枝杆菌培养及药物敏感试验耗时较长，延误其对临床的指导价值。新兴的一些分子生物学GeneXpert检测技术，能够进行快速药物敏感诊断而深受临床欢迎。未来开展新的分子诊断技术时，可以适当选择在术中取得组织来进行有效检测，以早期获得药物敏感试验结果，及时发现耐药，调整治疗方案，减少术后并发症发生。
总之，对于骨关节结核患者，术中优先选择脓液送检，尽量送检多种标本以提高阳性率。
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