骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是常见于儿童和青少年的原发性骨肿瘤，其恶性程度高、局部破坏性强，集中发生于股骨远端、胫骨近端及胫骨远端，且其远端转移能力极强[1]，早期诊断常见肺转移，5年生存率仅为70%[2]。近年来随着新辅助化疗和手术治疗技术的发展，OS患者的生存率有所提高，但其高复发率及转移率仍造成预后不良，与此同时肿瘤靶向基因治疗显示出良好的临床应用前景，因此，寻找新的OS基因治疗靶点逐渐成为近年来研究的热点。研究表明，OS组织中差异表达的微小RNA(microRNA，miR)-30c与OS患者总生存期显著相关[3-4]，但其可能的生物学功能及作用机制尚不明确。本研究通过建立过表达miR-30c OS细胞模型，初步探究miR-30c在体内外对OS细胞生物学行为的影响。
1 材料与方法
1.1 材料 成人OS细胞系U2OS、Saos2、Mg63、HuO9、KIKU、143B，hFOB1.19正常成骨细胞株均购自中科院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物研究所；PBS、胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培养基购自美国Gibco公司；TRIzol、反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；LipofectamineTM2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；细胞计数试剂盒(cell counting kit-8，CCK-8)购自美国Abmole公司；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；Transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel基质胶购自美国BD公司；miR-30c mimic及无意义小分子阴性对照片段由美国Abcam公司设计合成；PCR检测引物由南京金斯瑞生物科技有限公司设计合成，引物序列见表1。
1.2 Real-time PCR检测OS细胞系中miR-30c表达检测 常规操作培养6种人OS细胞系及正常成骨细胞系至对数生长期，取适量细胞参照TRIzol试剂说明书提取细胞总RNA，逆转录合成cDNAs，以U6作为内参基因，使用qRT-PCR试剂盒进行扩增。PCR反应体系20 μL，预设反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，设置40个循环；扩增结束后设置95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s做溶解曲线。采用2-△△Ct相对定量分析方法检测细胞中miR-30c的表达水平。实验过程中每种细胞样品配置4个副孔，同时做阴性对照排除反应体系中PCR污染及引物二聚体干扰。
表1 引物序列
Table 1 Primer sequence
引物名称引物序列U6Forward:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′Reverse:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′miR-30cForward:5′-TGTAAACATCCTACACTCTCAGG-3′Reverse:5′-CGCAACTACAGGTTCGGATC-3′
1.3 U2OS细胞培养及转染 成人OS细胞株U2OS用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基于37 ℃，5%CO2恒温培养箱中，2～3 d 1∶3传代培养。转染前1 d取对数生长期的细胞消化以1×105/孔的密度接种于24孔板内，待细胞密度长至70%～80%后，分为空白组、对照组及miR-30c过表达组，空白组不作任何处理，对照组与miR-30c过表达组分别转染miRNA无序阴性对照物及miR-30c mimic至细胞，细胞转染操作严格参照LipofectamineTM2000转染试剂盒说明书，转染后48 h收集细胞并进行后续研究。
1.4 克隆形成实验 取转染48 h后处于对数生长期的细胞消化并吹打成单个细胞，用含10%血清的DMEM培养基重悬备用。分别将3组细胞悬液接种到预热含10 mL培养基的100 mm培养皿中，每组设置5个平行对照，轻轻摇动分散细胞，于37 ℃，5%CO2恒温培养箱静置培养2～3周。当培养皿中出现肉眼可见的细胞克隆时终止培养，弃上清，用PBS润洗2～3次，加入5 mL 1∶3醋酸/甲醇固定细胞5 min，移除固定液，加入适量Giemsa染色液室温避光染色30 min，染色结束后用PBS反复缓慢冲洗培养皿，空气干燥后记录克隆形成率。
1.5 CCK-8检测细胞体外增殖活力 参照CCK-8试剂盒说明书操作，收集转染48 h的细胞消化以5×103个/孔的密度接种至96孔板中，于37 ℃，5%CO2恒温培养箱静置培养，分别于接种后24，48，72，96，120 h每孔加入10 μL CCK-8溶液混匀，注意避免产生气泡，将培养板放回培养箱中孵育2 h后用酶标仪检测每孔在450 nm处的吸光值。每组5个副孔，取平均值。
1.6 细胞凋亡检测 消化重悬转染48 h后的各组细胞，取5×104个细胞，1 000 g离心5 min，参照Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒说明书，加入195 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，按比例加入Annexin V-FITC和PI染色处理后上流式细胞仪(美国BD公司)检测，Modfit软件(美国Bio-Rad公司)分析各组细胞细胞周期分布。细胞凋亡检测结果由4个象限组成，左下象限代表正常细胞[An(-)/PI(-)]，右下代表早期凋亡细胞[An(+)/PI(-)]，右上代表晚期凋亡和坏死细胞[An(+)/PI(+)]，左上代表破损细胞[An(-)/PI(+)]，统计早期凋亡和晚期凋亡细胞占细胞总数的比例记为细胞凋亡率。
1.7 Transwell体外迁移和侵袭实验 消化收集转染后的细胞，用无血清的DMEM培养基洗涤2次后重悬细胞，调整细胞密度至5×104个/mL，取500 μL细胞悬液加入至Transwell小室内，向外室即24孔板内加入600 μL完全培养基至浸没小室下层，以提供细胞迁移运动趋化因子。常规培养36 h后弃去上下层培养基，PBS润洗3次，向下室中加入600 μL预冷的75%乙醇室温固定细胞30 min，吸出酒精至小室自然风干，加入600 μL 0.1%结晶紫常温避光染色15 min，清水冲洗小室3次，用棉签擦拭内室细胞及残留染料。室温晾干后显微镜下观察穿过微孔至滤膜反面的细胞，每个小室随机选取5个视野，每组设置4个平行副孔，拍照计数取平均值，比较转染后细胞体外迁移能力的变化。
细胞体外侵袭实验前1 d将10 g/L Matrigel胶用无血清的DMEM培养基1∶3稀释，混匀后取20 μL稀释后的Matrigel胶均匀铺在Transwell小室滤膜上，于37 ℃，5%CO2恒温培养箱包被过夜，后续操作与细胞迁移实验一致。
1.8 裸鼠体内成瘤实验 无特定病原体(specific pathogens free，SPF)级雌性裸鼠，4～5周龄，体重(17.83±1.64)g，随机分为3组，每组7只，购自常州卡文斯实验动物有限公司。消化收集转染后长至对数生长期的细胞离心并调整细胞浓度至2×107个/mL，PBS清洗1次后用1 mL生理盐水重悬细胞。75%乙醇清洁消毒裸鼠皮肤后用1 mL一次性注射器将收集的细胞悬液按每只裸鼠0.1 mL体积注入小鼠左腋皮下，穿刺点距离注射部位1 cm。SPF环境饲养接瘤后的裸鼠，定期观察裸鼠一般活动状况及皮下肿瘤形成情况，每周测量肿瘤大小，记录肿瘤块最大直径(a)、最小直径(b)，并计算肿瘤体积，计算公式为V(cm2)=ab2/2，绘制肿瘤生长曲线图。4周后脱颈处死裸鼠，剥除肿瘤并拍照，测量并记录裸鼠移植瘤瘤重。
1.9 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件分析数据。计量资料比较采用单因素方差分析、SNK-q检验和重复测量的方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 miR-30c低表达于多种OS细胞系 通过qRT-PCR对正常成骨细胞hFOB1.19及U2OS、Saos2、Mg63、HuO9、KIKU、143B等6种OS细胞中miR-30c的表达情况进行倍数变化归一化分析。结果表明，6种OS细胞系中miR-30c表达水平均明显低于hFOB1.19细胞，其中U2OS细胞中miR-30c表达水平最低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。因此，选择U2OS作为候选细胞系开展后续研究。
表2 miR-30c在OS细胞系中相较于正常成骨细胞的表达比较
Table 2 The expression of miR-30c in six OS cell lines compared with normal osteoblast cells
细胞系miR-30c表达倍数hFOB1.195.26±0.53U2OS0.27±0.06∗Saos22.34±0.35∗Mg631.84±0.20∗HuO92.09±0.44∗KIKU1.22±0.39∗143B2.10±0.18∗F值17.913P值<0.001
*P值<0.05与hFOB1.19比较(SNK-q检验)
2.2 miR-30c抑制U2OS细胞体外克隆形成 通过平板克隆形成实验检测miR-30c对U2OS细胞单细胞干性及克隆形成能力的影响。空白组与对照组克隆形成数目差异无统计学意义(P>0.05)，说明miR-30c mimic无意义对照物不对实验结果产生影响。miR-30c过表达组克隆数目明显少于对照组和空白组，差异有统计学意义(P<0.05)，说明miR-30c抑制U2OS细胞体外干性及克隆形成能力。见图1，表3。
图1 miR-30c对U2OS细胞体外克隆形成的影响
A.空白组；B.对照租；C.miR-30c过表达组
Figure 1 Effect of miR-30c on colony formation of U2OS cells in vitro
表3 各组细胞克隆形成数目比较
Table 3 Comparison of the number of cell clones in each group 
个)
组别 克隆数目空白组 232±46对照组 228±31miR-30c过表达 76±10∗#F值 29.140P值 <0.001
*P值<0.05与空白组比较 #P值<0.05与对照组比较(SNK-q检验)
2.3 miR-30c抑制U2OS细胞增殖 CCK-8法检测铺板24，48，72，96，120 h各组细胞增殖情况。随时间延长，各组细胞增殖能力呈升高趋势，但miR-30c过表达组细胞增殖能力明显低于空白组和对照组，组间、时点间、组间·时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。
2.4 miR-30c促进U2OS细胞凋亡 流式细胞术检测miR-30c对U2OS细胞凋亡的影响。过表达miR-30c组U2OS细胞凋亡率明显高于空白组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。
表4 各组细胞增殖能力比较
Table 4 Comparison of cell proliferation in each group 
组别24h48h72h96h120h空白组0.21±0.040.29±0.030.42±0.050.54±0.040.81±0.06对照组0.20±0.030.28±0.050.39±0.050.57±0.070.73±0.05miR-30c过表达0.21±0.020.27±0.060.32±0.050.39±0.040.44±0.06组间F值=31.256 P值<0.001时点间F值=103.414 P值<0.001组间·时点间F值=22.081 P值=0.019
表5 各组细胞凋亡率比较
Table 5 Comparison of apoptosis rate in each group
组别细胞凋亡率空白组5.35±0.83 对照组6.01±1.02 miR-30c过表达24.01±2.57∗#F值66.200P值<0.001
*P值<0.05与空白组比较 #P值<0.05与对照组比较(SNK-q检验)
2.5 miR-30c抑制U2OS细胞体外侵袭和迁移 在体外培养36 h后，miR-30c过表达组细胞转染miR-30c mimic后侵袭细胞数和迁移细胞数明显低于空白组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2，表6。
2.6 miR-30c抑制U2OS细胞体内成瘤能力 跟踪观察并记录接瘤4周内裸鼠皮下移植瘤体积变化趋势及剖瘤后瘤体积及瘤重间差异，以衡量miR-30c在体内对U2OS细胞增殖的影响。结果表明，裸鼠皮下接瘤4周后，miR-30c过表达组小鼠体内移植瘤体积和重量明显小于空白组和对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，说明过表达miR-30c可以抑制U2OS细胞皮下成瘤能力。见表7。
图2 miR-30c对细胞体外迁移侵袭的影响
A.空白组侵袭细胞;B.对照组侵袭细胞;C.miR-30c过表达组侵袭细胞;D.空白组迁移细胞;E.对照组迁移细胞;F.miR-30c过表达组迁移细胞
Figure 2 Effects of microRNA-30c on cell migration and invasion in vitro
表6 各组细胞侵袭、迁移数量比较
Table 6 Comparison of cell migration and invasion in each group 
个)
组别侵袭细胞数迁移细胞数空白组112±13135±11对照组105±13130±13miR-30c过表达 62±10∗# 77±12∗#F值24.64141.096P值<0.001<0.001
*P值<0.05与空白组比较 #P值<0.05与对照组比较(SNK-q检验)
表7 各组细胞体内成瘤的影响
Table 7 The effect of tumor formation ability in each group
组别肿瘤体积(cm3)肿瘤重量(g)空白组2.73±0.201.70±0.23对照组2.89±0.301.80±0.35miR-30c过表达1.43±0.22∗#0.70±0.10∗#F值75.47741.909P值<0.001<0.001
*P值<0.05与空白组比较 #P值<0.05与对照组比较(SNK-q检验)
3 讨 论
微小核糖核酸(micro ribonucleic acids,miRNAs)是在动植物基因组中均广泛存在的一类由20～24个核苷酸组成的内源新高度保守的非编码RNA。研究表明miRNAs参与调节细胞分化、增殖、代谢和凋亡等多种正常生理功能，其在生物体内的异常表达导致多种疾病及肿瘤的发生[5-6]。近年来，研究者已从OS中筛选出一些异常表达的miRNAs，例如miR-34可通过抑制Notch信号途径抑制成骨细胞分化，促进OS发生[7]；miR-16可靶向抑制丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase/extracellular signal-regulated kinase，MAPK/ERK)信号通路，沉默胰岛素样生长因子1受体(Insulin like growth factor 1 receptor, IGF1R)表达，抑制成骨细胞生长[8]。另一方面，miR-30c作为miR-30家族的重要成员之一，在多种肿瘤细胞的增殖和侵袭过程中发挥着重要作用[9]，而其在OS中可能发挥的生物学功能及作用机制尚不明确，因此本研究旨在通过验证miR-30c在OS中可能发挥的生物学功能，为进一步揭示OS的发病机制及其靶向治疗提供新的依据。
通过对OS及其相关细胞系全基因组表达谱分析发现miR-30c表达普遍下调，但仍存有相反的报道[10-11]。因此本研究基于对U2OS、Saos2、Mg63、HuO9、KIKU、143B 6种OS细胞系及人正常成骨细胞hFOB1.19中miR-30c的表达进行定量PCR分析，结果表明miR-30c在6种OS细胞系中的表达均明显低于hFOB1.19细胞，显示出低表达趋势，且U2OS细胞中miR-30c最低，因此选取U2OS作为后续功能研究的目的细胞系。通过构建U2OS细胞miR-30c过表达细胞系进一步验证miR-30c在U2OS细胞中的作用。结果显示，在克隆形成和CCK-8实验中，过表达miR-30c显著抑制U2OS细胞体外增殖及克隆形成能力，提示miR-30c可能通过作为抑癌基因参与OS的发生发展。细胞凋亡结果显示过表达miR-30c能促进细胞凋亡，miR-30c可能通过诱导U2OS细胞程序性死亡发挥抑癌作用。细胞迁移及侵袭实验结果显示，过表达miR-30c显著抑制U2OS细胞体外转移，考虑到OS早期易发生肺转移的特性，提示miR-30c可能通过抑制OS细胞转移从而抑制OS的发展，进一步发挥抑癌作用。另一方面，由于体内外有着诸多不同的差异且生物体内具有复杂的调控系统，通过构建裸鼠移植瘤模型验证miR-30c是否能在生物体内发挥相似的生物学作用，结果显示，接瘤4周后miR-30c过表达组小鼠体内移植瘤体积和重量明显小于空白组和对照组(P<0.05)，提示miR-30c在体内可能通过抑制肿瘤发生及OS细胞增殖发挥一定程度的抑癌作用。
参考以往文献报道，miRNA在OS发病进程中的作用机制常分为抑癌基因和致癌基因[12]，其中以miR-300、miR-301a、miR-20a为代表发挥典型促进OS细胞系增殖及细胞周期进程[13-14]，同时，miR-138、miR-497、miR-218等在OS早期诊断和预后中可发挥重要抑癌作用[15-16]，并与肿瘤分期、远端转移等密切相关。与这些miRNA作用相似的，本研究初步论证了miR-30c在OS U2OS细胞系可作为抑癌基因发挥重要的生物学功能，为标识OS的发生提供了新的参考依据，但作为庞大信号分子中的一员，miR-30c在U2OS细胞中进一步的作用机制仍有待阐明，接下来将进一步探究miR-30c及其下游信号分子调节机制，为后期实现OS的靶向治疗提供新的依据。
总之，miR-30c有望成为OS肿瘤基因治疗的潜在高效靶点。
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