结核病是全球范围内导致死亡的十大原因之一，也是单一传染源导致死亡的主要原因。根据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)估计，世界上约有四分之一的人口感染结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)，且耐药结核病是威胁公共卫生的重大问题，几乎占全球耐多药结核病(multi-drug resistant tuberculosis，MDR-TB)的一半，中国以13%耐药比例位列第2，耐药形势十分严峻[1-2]。结核病的耐药性监测对于指导合理使用抗生素起着至关重要的作用，由于传统的结核菌培养联合抗结核药物的敏感性试验(药敏试验)仍是目前诊断结核病和耐药结核病的“金标准”，但确诊周期较长，不利于结核病及耐药结核病的防控[3-4]。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，对MTB核酸及异烟肼、利福平等抗结核药物基因突变进行快速检测逐渐被广泛接受。WHO推荐的Gene Xpert MTB/RIF技术(Xpert法)采用实时荧光定量核酸扩增技术，可以及时快速对样本中的MTB核酸进行提取和检测，同时报告待检样本中MTB的利福平耐药情况[5-7]。MTB核酸检测(PCR-荧光探针法)能快速有效对样本中的MTB进行检出，MTB耐药基因检测(DNA微阵列芯片法)对检出的阳性样本中MTB的异烟肼和利福平耐药情况能够快速准确进行检测，具有较好的临床应用价值[8-9]。本研究对Xpert法、BD960液体快速培养法(BD960法)联合快速药物敏感试验(药敏试验)、MTB核酸检测(TB-DNA法)联合MTB耐药基因检测法(DNA芯片法)进行比较，分析不同方法检测MTB及耐药情况的效能，评估其在结核病及耐药结核病控制中的应用价值。
1 资料与方法
1.1 一般资料 回顾性分析2018年7月—2019年6月在河北省胸科医院就诊的经临床明确诊断为肺结核患者246例，男性167例，女性79例，年龄15～86岁，平均(43.90±19.69)岁。患者标本包含痰标本143例，支气管肺泡灌洗液103例，所有标本均进行MTB鉴定，鉴定方法分别为BD960法、Xpert法和TB-DNA法。所有进行MTB鉴定阳性标本均对应进行耐药情况分析，对应方法包括药敏试验、Xpert法和DNA芯片法。其中部分样本参照实验室标准操作规程和试剂说明书进行了萋-尼抗酸染色、抗酸染色涂片检查(夹层杯法)及纤维支气管镜刷片抗酸染色检测。
1.2 检测方法
1.2.1 BD960法联合药敏试验 严格参照使用说明书进行操作，BD960法，试验标本均用1～2倍体积4%NaOH溶液消化15～20 min，加入无菌磷酸盐缓冲液混匀后离心，弃上清液，加入1 mL磷酸盐缓冲液重悬沉淀物，混匀后取0.5 mL接种于MGIT960液体快速结核菌培养基中，放入BACTEC MGIT960快速培养系统(Becton Dickinson公司，美国)中进行培养。药敏试验根据CLSI M24-A微量肉汤稀释法原理，将药物包括菌群分类药物事先包被在U-底板上，将结核菌研磨比浊为1麦氏单位，以培养基稀释后加入测试孔，根据各孔的培养结果获得MIC数据成界值范围，以此判断药物敏感性。
1.2.2 Xpert法 按照使用说明书进行操作，加入样本处理液，充分混匀后，室温孵育15 min，使用新的移液管将2 mL混合液加入试剂匣(Cepheid产品，美国)，最后放入检测模块中进行上机检测。反应结束后，在检测系统窗口下直接观察测试结果。MTB数量以MTB DNA拷贝分为高、中、低(极低)和未检出进行报告，利福平检测结果为敏感和耐药。
1.2.3 MTB核酸检测联合MTB耐药基因检测 样本中加入1～2倍体积的4%NaOH前处理液，充分摇匀后，室温孵育15～20 min。取液化后标本1 mL加入1.5 mL离心管中，12 000 r/min离心5 min。弃上清液，沉淀中加入1 mL清洗液混匀，12 000 r/min离心5 min，重复洗涤1次。弃上清液，加入50 μL已混匀的DNA提取液，用移液器充分混匀后转入核酸提取管。将核酸提取管放入振荡器中，最高速率震荡10 min。震荡完成后，将核酸提取管进行95 ℃ 5 min加热孵育。加热后12 000 r/min离心5 min，上清即为核酸样本。参照分枝杆菌检测试剂盒(PCR-荧光探针法，成都博奥晶芯生物科技有限公司)说明书进行PCR。MTB核酸检测报告阳性的核酸样本，参照MTB耐药基因检测试剂盒(DNA微阵列芯片法，成都博奥晶芯生物科技有限公司)说明书进行耐药基因检测。
1.3 统计学方法 应用SPSS22.0统计软件处理数据。检测结果一致性采用Kappa检验分析，Kappa值<0.4为一致性较差，Kappa值0.4～0.75为中度一致，Kappa值>0.75为高度一致。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 不同检测方法对临床样本中MTB阳性检出率比较 BD960法的MTB阳性检出率低于分枝杆菌核酸检测和Xpert 法，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。对于结核分枝杆菌的快速检测及鉴定方法，其中部分样本还进行了萋-尼抗酸染色、抗酸染色涂片检查(夹层杯法)及纤维支气管镜刷片抗酸染色检测，均是直接对样本中MTB进行病原学染色观察。萋-尼抗酸染色检测阳性率为47.69%(31/65)，抗酸染色涂片检查(夹层杯法)检测阳性率为80.10%(161/201)，纤维支气管镜刷片抗酸染色检测阳性率为40.63%(39/96)。3种病原学染色阳性检出率均显著低于BD960液体快速培养法(χ2=61.361，9.279，94.059，P<0.05)、MTB核酸检测法(χ2 =118.490，39.008，152.980，P<0.05)和Xpert法(χ2 =144.471，53.767，175.275，P<0.05)，因3种病原学染色阳性检出率未达预期，文中不作进一步分析。
表1 3种方法检测MTB阳性检出率比较
Table 1 Comparison of the positive detection rate of three methods for detecting MTB (n=246，例数，%)
检测方法MTB检测结果阳性阴性BD960法222(90.24) 24(9.76)MTB核酸检测241(97.97)∗5(2.03)Xpert法246(100.00)∗0(0.00) χ2值34.529 P值<0.001
*P值<0.05与BD960法比较(χ2检验)
2.2 不同检测方法对临床样本中MTB耐药检出率比较 3种方法对利福平耐药检出率差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。
表2 3种方法对利福平耐药检出率比较
Table 2 Comparison of the detection rates of resistance to rifampicin by three methods (例数，%)
检测方法例数MTB耐药检测结果利福平耐药利福平敏感药敏试验22247(21.17)175(78.83)MTB耐药基因检测24151(21.16)190(78.84)Xpert法24658(23.58)188(76.42)χ2值0.544P值0.762
以快速药物敏感试验检测结果作为检测“标准”，进一步分析Xpert 法和MTB耐药基因检测的检测效能，敏感度分别为95.65%(44/46)和91.30%(42/46)，特异度分别为93.57%(160/171)和95.32%(163/171)，阳性预测值分别为80.00%(44/55)和84.00%(42/50)，阴性预测值分别为98.77%(160/162)和97.60%(163/167)，准确度分别为94.01%(204/217)和94.47%(205/217)，约登指数分别为89.22%和86.63%，均在80%以上。
为保证分析结果的可比性与准确性，已剔除BD960液体快速培养法和分枝杆菌核酸检测MTB为阴性的样本。以快速药敏试验检测结果作为检测“金标准”，Xpert 法和MTB耐药基因检测利福平耐药结果高度一致，Kappa值分别为0.833和0.840(均P<0.05)，见表3。
表3 3种利福平耐药检测方法一致性分析
Table 3 Analysis of consistency results of three methods for detection of rifampicin resistance (n=217，例数)
Xpert法快速物敏试验利福平耐药利福平敏感MTB耐药基因检测快速药敏试验利福平耐药利福平敏感利福平耐药4411利福平耐药428利福平敏感2160利福平敏感4163Kappa值0.833Kappa值0.840P值<0.001P值<0.001
快速药物敏感试验和MTB耐药基因检测能对常规一线抗结核药物——异烟肼耐药情况进行检测，结果显示，2种方法异烟肼耐药结果检出率差异无统计学意义(P>0.05)，见表4。
表4 异烟肼耐药检测方法检出结果差异分析
Table 4 Analysis of the difference in detection results of isoniazid resistance (例数，%)
方法例数MTB耐药检测结果异烟肼耐药异烟肼敏感快速药物敏感试验22270(31.53)152(68.47)MTB耐药基因检测24162(25.73)179(74.27)χ2值1.911P值0.167
3 讨 论
MTB尤其是耐药MTB的产生与传播是导致结核病发病率居高不下的重要原因之一。目前MTB的细菌学检测仍是结核病诊断、治疗的重要依据，萋-尼抗酸染色、电子支气管镜刷片抗酸染色及抗酸染色涂片检查(夹层杯法)检测是目前实验室常规直接对样本中MTB进行病原学染色观察的方法，本研究中萋-尼抗酸染色和纤维支气管镜刷片抗酸染色阳性检出率仅为47.69%(31/65)和40.63%(39/96)，抗酸染色涂片检查(夹层杯法)阳性检出率为80.10%(161/201)，与文献报道的操作简单快速但阳性检出率和敏感度不高结果一致[10-12]。
Xpert法是集样本处理、核酸提取和扩增、MTB核酸特异性检测及利福平耐药基因rpoB突变检测于一体的结核病和利福平耐药结核病快速诊断方法[13-14]。研究显示，PCR-荧光探针法可快速检测样本中是否含有MTB，具有临床推广应用价值[15]。本研究结果显示，BD960法对MTB的阳性检出率低于MTB核酸检测和Xpert法，差异有统计学意义(P<0.05)。进一步分析阳性检出率差异发现，BD960法报告的9.76%(24/246)MTB阴性结果中，在Xpert检测结果中MTB带菌量低(极低)占79.17%(19/24)，带菌量中占16.67%(4/24)，带菌量高占4.16%(1/24)；MTB核酸检测法报告的2.03%(5/246)MTB阴性结果中，Xpert法检测MTB带菌量低(极低)占80.00%(4/5)，带菌量中占20.00%(1/5)，这些中、低浓度带菌量的样本是造成阳性检出差异的主要原因。因此，MTB核酸检测和Xpert法更有利于结核病的诊治和预防，但是需要专业熟练地操作、配套使用的仪器和试剂盒，限制了其在地方性医院的推广。
目前，多重耐药和广泛耐药结核病仍以MTB耐药性测试或抗菌药物敏感性测试为主。本研究结果显示，3种方法利福平耐药检出率差异无统计学意义(P>0.05)。以快速药物敏感试验检测结果作为检测“金标准”，Xpert法和MTB耐药基因检测利福平耐药结果高度一致(Kappa值均大于0.75)，敏感度、特异度、阴性预测值和准确度均大于90%，阳性预测值和约登指数均在80%以上，与以往的研究报道结果一致[7,16]。此外，快速药物敏感试验及MTB耐药基因检测还能够对样本中异烟肼耐药情况进行分析，结果显示，2种检测方法结果差异无统计学意义(P>0.05)，与文献报道结果一致[17]。
研究过程中发现一些造成差异的可能原因，当临床样本中MTB带菌量低(极低)时，BD960快速培养和MTB核酸检测因最低检测限阈值问题造成结果易产生“假阴性”；当样本中野生型模板背景较高时，易产生非特异性扩增的“假阳性”，同时Gene Xpert技术在检测样本带菌量极低时，可能会出现假耐药的情况；表型耐药与基因型突变会存在一定差异，基于基因突变并不能完全涵盖所有突变位点的检测，样本中MTB浓度低时无法进行MTB耐药基因检测等[18-19]。因此，在实际临床应用中需结合表型和基因型检测方法，提高检测敏感度和特异度，以提高准确预测耐药性和耐药结核病治愈的可能性。
综上所述，Xpert法和MTB核酸检测能够快速准确地对样本中是否含有MTB进行检测，快速药物敏感试验、MTB耐药基因检测和Xpert法能够对样本中利福平(异烟肼)耐药情况进行分析，且MTB耐药基因检测和Xpert法具有较高的敏感度和特异度，可结合实际需求在耐多药结核病防治中推广和应用。
[1] 余卫业,谭卫国,罗一婷,等.2018WHO全球结核报告:全球与中国关键数据分析[J/CD].新发传染病电子杂志,2018,3(4):228-233.
[2] 李国保，柯学，陈园园.结核病重症加强治疗病房建设与管理专家共识(2018)[J].中华结核和呼吸杂志,2018,41(1):19-24.
[3] 马爱静,赵雁林.耐药结核病的流行和监测现状[J].中国抗生素杂志,2018,43(5):502-506.
[4] Jain AK,Jaggi KR,Bhayana H,et al. Drug-resistant spinal tuberculosis[J]. Indian J Orthop,2018,52(2):100-107.
[5] Somily AM,Barry MA,Habib HA,et al. Evaluation of GeneXpert MTB/RIF for detection of Mycobacterium tuberculosis complex and rpo B gene in respiratory and non-respiratory clinical specimens at a tertiary care teaching hospital in Saudi Arabia[J]. Saudi Med J,2016,37(12):1404-1407.
[6] Tang T,Liu F,Lu X,et al.Evaluation of GeneXpert MTB/RIF for detecting Mycobacterium tuberculosis in a hospital in China[J]. J Int Med Res,2017,45(2):816-822.
[7] 李静,梁亚萍,王卓,等.微孔板法与GeneXpert MTB/RIF技术检测结核分枝杆菌对利福平耐药性的价值[J].中国防痨杂志,2019，41(2):162-168.
[8] 张辉,黄晓英,李素红.3种方法检测结核分枝杆菌检测的比较[J].河南预防医学杂志,2018,29(7):498-499.
[9] 单永梅,王伟炳,王建美.DNA微阵列芯片法检测耐药结核分枝杆菌的临床应用价值研究[J].中国防痨杂志,2018,40(10):1083-1088.
[10] 赵慧,王春花,孙蕊,等.萋-尼氏抗酸染色法和金胺O荧光染色法在结核分枝杆菌痰涂片检测中的对比[J].天津医科大学学报,2018,24(4):357-360.
[11] 魏雯，高涛，武永平.两种方法对结核杆菌耐多药性检测结果的比较[J].医学动物防制，2016,32(2):231-233.
[12] 周喜桃,张跃军,曾莉怡,等.Xpert MTB/RIF检测技术在结核病诊断中的价值[J].中国防痨杂志,2018,40(12):1335-1340.
[13] 范国萍,潘爱珍,黄有平,等.GeneXpert MTB/RIF技术诊断新发结核分枝杆菌感染的价值研究[J].中华医院感染学杂志,2019,29(10):1447-1450.
[14] 丁月荷,卓玛,李沛军,等.Gene X-pert MTB/RIF技术对结核病和耐药结核病的诊断价值[J].青海医药杂志,2016,46(9):74-76.
[15] 杨振兴,陈威,许敏,等.五种检测方法在结核病诊断中的应用评价[J].中国热带医学,2016,16(10):1024-1026，1035.
[16] 欧维正,骆科文,王燕,等.基因芯片和比例法药物敏感性试验检测结核分枝杆菌对利福平和异烟肼耐药性的比较研究[J].检验医学,2013,28(5):404-407.
[17] 马进宝,杨翰,任斐,等.三种分子生物学方法检测结核分枝杆菌耐药性的效能分析[J].中国防痨杂志,2019,41(4):440-446.
[18] Schön T,Miotto P,Koeser CU,et al. Mycobacterium tuberculosis drug-resistance testing: challenges,recent developments and perspectives[J]. Clin Microbiol Infect,2017,23(3):154-160.
[19] 刘元,周俊,崔晓利,等.GeneXpert MTB/RIF检测结核分枝杆菌对利福平耐药假阳性与标本低水平荷菌量的关系[J].中国防痨杂志,2019,41(2):176-180.