骨组织可持续再生，但在病理状态下这种自我修复能力会被降低。糖尿病等疾病破坏骨转换平衡，导致骨组织再生障碍，骨修复能力受损，骨微结构异常而易于发生脆性骨折[1]。骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs)具有多向分化潜能，可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等[2]，其向成骨细胞分化能力在骨质疏松症发病中具有重要意义。BMSCs分化方向受多种因素调节，尤其是转录后调节因子。其中，具有盘状同源区域结合序列的转录共活化因子(transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，TAZ)具有广泛生物学功能，参与调节BMSCs成骨-成脂分化平衡[3]。TAZ通过结合Runt相关转录因子2(runt related transcription factor 2，RUNX2)促进成骨分化，或结合过氧化物酶体增生物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptorγ，PPARγ)抑制成脂分化[4-5]。作为胰岛素通路的枢纽因子，胰岛素受体底物1(insulin receptor substrate 1，IRS-1)在糖尿病、骨质疏松症中的作用举重若轻。目前，关于IRS-1对BMSCs分化的影响尚有争议。据报道，IRS-1胞内蓄积有利于细胞向成软骨方向分化[6]。也有其他学者认为，IRS-1是细胞分化的抑制因子[7-8]。据此，本研究将进一步探索IRS-1/TAZ信号转导调节BMSCs向成骨细胞分化的潜在机制，为干细胞分化调控程序提供新靶点。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物 3月龄SPF级雌性未受孕SD(Sprague Dawley)大鼠15只，用于动物实验；4周龄SD大鼠9只，用于BMSCs的原代培养。实验动物购于河北医科大学实验动物中心，动物合格证书号 1708080。
1.2 动物分组及骨质疏松模型的构建 将15只3月龄SD大鼠随机分为对照组、假手术组、去卵巢手术(ovariectomy，OVX)组，每组5只。去卵巢手术操作步骤如下：大鼠禁食禁水12 h后，对其进行麻醉，于俯卧位对大鼠卵巢进行定位，消毒手术部位，依次剪开皮肤、肌肉及筋膜，分离脂肪团，手术结扎输卵管，完整切除双侧卵巢，止血并逐层缝合。假手术组仅切除卵巢等体积大小脂肪组织，保留卵巢。术后3 d内连续应用抗生素预防感染。术后12周用于后续实验。
1.3 大鼠BMSCs的原代培养及成骨分化 将4周龄SD大鼠CO2麻醉后处死，用75%乙醇浸泡5 min。在无菌条件下取双侧股骨，剪除股骨近端骨骺，用5 mL注射器吸取DMEM培养基反复冲洗骨髓腔，用1 mL注射器反复抽吸制成细胞悬液。细胞取出后，以5×106/cm2的密度接种于含12%胎牛血清及1%青链霉素的DMEM培养基中，放入细胞培养箱中培养。原代细胞达到80%融合后传代，P3代细胞用于后续实验。应用成骨诱导培养基(DMEM含12%胎牛血清，1%青链霉素，10 nmol/L地塞米松，10 mmol/L β-甘油磷酸和50 mg/L抗坏血酸)诱导BMSCs向成骨细胞分化。
1.4 微型电脑断层成像(micro-computed tomography，μCT)分析 取SD大鼠股骨，用4%多聚甲醛固定，4 ℃，24 h。应用高分辨率μCT (SkyScan,1176)对股骨进行扫描分析(65 kv,153 μA),分辨率9.0 μm/pixel。应用重建软件(NRecon,v1.6,SkyScan)、数据分析软件(CTAn,v1.9,SkyScan)和三维模型可视化软件(CTVol,v2.0,SkyScan)对扫描图像进行处理和分析。分析指标包括骨小梁体积分数(bone volume fraction,BV/TV)，骨小梁厚度(trabecular thichness,Tb.Th)和骨小梁分离度(trabecular separation,Tb.Sp)。
1.5 免疫荧光分析 取SD大鼠股骨，用4%多聚甲醛固定，4 ℃，24 h；0.5 mol/L乙二胺四乙酸脱钙3周，4 ℃，摇床；应用8%明胶包埋，制作20 μm冰冻切片。将冰冻切片于37 ℃烘干，浸泡于PBS液15 min，5% BSA封闭1 h，一抗孵育(抗大鼠IRS-1，Abcam)，4 ℃，过夜；TBST清洗，荧光二抗孵育1 h，TBST清洗，DAPI封片。采用Image J软件对荧光强度进行统计分析。
1.6 质粒转染 课题组在前期实验中已经自行构建IRS-1高表达质粒(pCMV-IRS-1)[9]。本实验构建了分别用于敲除IRS-1和TAZ表达的质粒，即嵌入敲除IRS-1表达的小干扰RNA(SiIRS-1)的质粒，和嵌入敲除TAZ表达的小干扰RNA(SiTAZ)的质粒(上海吉凯基因化学有限公司)。应用脂质体3 000(Thermo)对BMSCs进行转染。细胞转染24 h后，更换为成骨诱导培养基进行培养。同时为上述实验设立对照，未进行质粒转染组设置为“空白对照组”，转染空白质粒组作为“阴性对照组”。
1.7 茜素红染色 将细胞接种至35 mm塑料培养皿中，成骨诱导基培养14 d。PBS清洗2次，4%多聚甲醛室温固定20 min。蒸馏水清洗3次后，0.1%茜素红染色，37 ℃，30 min。蒸馏水清洗3次后，显微镜下拍照。然后，应用10%氯化十六烷基吡啶对茜素红进行脱色，室温，30 min。应用酶标仪(562 nm)读取其吸光度值。
1.8 蛋白免疫印迹(Western blot) 将细胞接种至60 mm塑料培养皿中，成骨诱导基培养3 d。利用RIPA裂解液提取蛋白。应用12% SDS-PAGE胶对蛋白进行电泳分离后，采用半干法将其转移至PVDF膜。5%牛奶封闭，37 ℃，室温。一抗孵育(抗TAZ，Cell Signaling；抗RUNX2，Boster；抗骨钙蛋白(osteocalcin,OCN)，Boster；抗GAPDH，Bioworld)，4 ℃，过夜。二抗37 ℃孵育1 h。应用image J软件分析蛋白条带灰度值，并计算目的蛋白与内参蛋白条带灰度值的比值。
1.9 统计学方法 应用SPSS 20.0统计软件分析数据。计量资料比较采用单因素方差分析和SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 不同组别大鼠股骨μCT和IRS-1免疫荧光染色比较 采用μCT对大鼠股骨的松质骨相关指标进行分析，结果显示，3组间BV/TV值、Tb.Th值、Tb.Sp值差异有统计学意义(P<0.05)；OVX组BV/TV值、Tb.Th值低于对照组和假手术组，Tb.Sp值高于对照组和假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组和假手术组BV/TV值、Tb.Th值、Tb.Sp值差异无统计学意义(P>0.05)。采用免疫荧光染色定量分析大鼠股骨IRS-1的表达量，结果显示，3组间IRS-1+荧光强度百分比差异有统计学意义(P<0.05)；OVX组IRS-1+荧光强度百分比低于对照组和假手术组，差异有统计学意义(P<0.05)；对照组和假手术组IRS-1+荧光强度百分比差异无统计学意义(P>0.05)。见图1，表1。
图1 不同组别大鼠股骨μCT结果和IRS-1荧光染色的比较
A.不同组别大鼠股骨μCT比较；B.不同组别大鼠股骨IRS-1比较(荧光染色 ×200)
Figure 1 The μCT results of rat femurs and IRS-1 immunofluorescence results in different groups
表1 不同组别大鼠股骨μCT定量分析和IRS-1
免疫荧光染色定量分析比较
Table 1 The quantitative analysis of μCT results of rat femurs and IRS-1 immunofluorescence results in different groups 
组别μCT结果BV/TV(%)Tb.Th(mm)Tb.Sp(mm)IRS-1+荧光强度百分比(%)对照组24.68±5.320.24±0.050.68±0.0816.44±2.63假手术组25.29±4.760.27±0.060.66±0.0515.24±2.19OVX组9.34±2.43∗#0.11±0.01∗#1.25±0.17∗#4.97±0.82∗# F值21.54617.50044.53748.136 P值<0.001<0.001<0.001<0.001
*P值<0.05与对照组比较 #P值<0.05与假手术组比较(SNK-q检验)
2.2 IRS-1基因高表达对茜素红染色结果和成骨分化相关蛋白表达的影响 BMSCs成骨诱导14 d后，对其进行茜素红染色，结果显示，应用pCMV-IRS-1转染后，IRS-1组BMSCs的钙结节明显多于空白对照组和阴性对照组(图2A)。进一步对茜素红吸光度进行定量分析后发现，3组间茜素红吸光度差异有统计学意义(P<0.05)；IRS-1组茜素红吸光度高于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；空白对照组和阴性对照组茜素红吸光度差异无统计学意义(P>0.05)。BMSCs成骨诱导3 d后，采用Western blot方法分析成骨分化相关蛋白TAZ、RUNX2、OCN的表达水平，结果显示，IRS-1组TAZ、RUNX2、OCN的表达量明显高于空白对照组和阴性对照组(图2B)。进一步对蛋白条带灰度值进行定量分析后发现，3组间TAZ、RUNX2、OCN的表达量差异有统计学意义(P<0.05)；IRS-1组TAZ、RUNX2、OCN的表达量高于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；空白对照组和阴性对照组TAZ、RUNX2、OCN的表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见图2，表2。
图2 IRS-1基因高表达对茜素红染色结果和成骨分化相关蛋白表达的影响
A.IRS-1基因高表达对茜素红染色结果的影响(×200)；B.IRS-1基因高表达对成骨分化相关蛋白表达的影响
Figure 2 The effects of high expression of IRS-1 mRNA on alizarin red staining results and the expression of osteogenic differentiation related proteins
表2 IRS-1基因高表达对茜素红染色和TAZ、RUNX2、OCN表达影响的定量分析 Table 2 The quantitative analysis of the effects of high expression of IRS-1 mRNA on alizarin red staining results and the expression of osteogenic differentiation related proteins 
组别 茜素红吸光度成骨分化相关蛋白相对表达水平TAZ/GAPDHRUNX2/GAPDHOCN/GAPDH空白对照组0.20±0.010.21±0.010.18±0.020.38±0.04阴性对照组0.21±0.010.23±0.040.24±0.030.39±0.02IRS-1组 0.42±0.01∗#1.08±0.13∗#0.57±0.05∗#0.82±0.08∗#F值 463.000119.338104.44767.607P值 <0.001<0.001<0.001<0.001
*P值<0.05与空白对照组比较 #P值<0.05与阴性对照组比较(SNK-q检验)
2.3 IRS-1或TAZ基因敲除对茜素红染色结果和成骨分化相关蛋白表达的影响 茜素红染色结果提示， SiIRS-1组和SiTAZ组的钙结节明显少于空白对照组和阴性对照组(图3A)。进一步对茜素红吸光度进行定量分析后发现，4组间茜素红吸光度差异有统计学意义(P<0.05)；SiIRS-1组和SiTAZ组茜素红吸光度低于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；空白对照组和阴性对照组、SiIRS-1组和SiTAZ组差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果显示，SiIRS-1组和SiTAZ组TAZ、RUNX2、OCN的蛋白表达量明显低于空白对照组和阴性对照组(图3B)。进一步对蛋白条带灰度值进行定量分析后发现，4组间TAZ、RUNX2、OCN的表达量差异有统计学意义(P<0.05)；SiIRS-1组和SiTAZ组TAZ、RUNX2、OCN的表达量低于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；空白对照组和阴性对照组、SiIRS-1组和SiTAZ组间TAZ、RUNX2、OCN的表达量差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。
图3 IRS-1或TAZ基因敲除对茜素红染色结果和成骨分化相关蛋白表达的影响
A.IRS-1或TAZ基因敲除对茜素红染色结果的影响(×200)；B.IRS-1或TAZ基因敲除对成骨分化相关蛋白表达的影响
Figure 3 The effects of IRS-1 or TAZ knockout on alizarin red staining results and the expression of osteogenic differentiation related proteins
表3 IRS-1或TAZ基因敲除对茜素红染色和TAZ、RUNX2、OCN表达影响的定量分析
Table 3 The quantitative analysis of the effects of IRS-1 or TAZ knockout on alizarin red staining results and the expression of osteogenic differentiation related proteins
组别 茜素红吸光度成骨分化相关蛋白相对表达水平TAZ/GAPDHRUNX2/GAPDHOCN/GAPDH空白对照组0.20±0.020.41±0.030.85±0.030.88±0.02阴性对照组0.19±0.010.38±0.050.83±0.050.80±0.11SiIRS-1组0.07±0.02∗#0.13±0.03∗#0.25±0.02∗#0.20±0.04∗#SiTAZ组0.05±0.02∗#0.09±0.03∗#0.22±0.04∗#0.19±0.02∗#F值 56.84663.442271.611115.662P值 <0.001<0.001<0.001<0.001
*P值<0.05与空白对照组比较 #P值<0.05与阴性对照组比较(SNK-q检验)
3 讨 论
骨质疏松症是一种以骨形成受损、骨吸收增加为特征的骨代谢疾病，骨量降低、骨微结构损害，骨折风险明显增加。近来，学者发现基因修饰干细胞可促进BMSCs向成骨细胞分化，改善骨细胞功能，在来源上增加骨形成[10]。同时，体外培养BMSCs在骨生理学研究领域广为应用，可作为干细胞基因修饰的种子细胞。本研究结果显示，IRS-1和TAZ之间存在相互作用，这种相互作用是调节BMSCs向成骨细胞定向分化的潜在机制，是联络糖尿病和骨质疏松症的关键因素，可作为基因修饰干细胞治疗的新靶点。
IRS-1是胰岛素信号转导的船坞蛋白，在胰岛素受体结合SH2结构蛋白中起锚定作用。同时，IRS-1本身含有21个酪氨酸磷酸化位点，可直接与SH2结构蛋白结合，进而激活下游信号通路[11]。此外，IRS-1还包含丝氨酸/苏氨酸残基，可被丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶磷酸化，抑制胰岛素受体酪氨酸蛋白激酶活性，进而参与调节细胞增殖、生长、分化等多种功能[12]。近来，研究发现IRS-1在成骨细胞和软骨细胞中表达，而不在破骨细胞表达[13-14]。进一步研究，IRS-1基因特异性敲低小鼠表现为成骨分化抑制，成骨细胞数量减少，导致骨形成率降低[15]。可见，IRS-1不仅是胰岛素抵抗的候选基因，在骨代谢中的作用也不容忽视。但是，目前关于IRS-1对细胞分化的作用尚存争议。IRS-1是一种细胞分化抑制因子。Xi等[16]体内外实验发现，敲低IRS-1减少p53/Kruppel样因子4复合体形成，促进血管平滑肌细胞增殖和分化。与此相反，多数学者认为IRS-1是一种细胞分化促进因子[17]。这可能是因为，不同细胞类型中，IRS-1对细胞分化的作用不尽相同。成肌细胞中研究发现，IRS-1是成肌细胞分化的必需因子，敲低IRS-1成肌细胞分化减少[18]。本研究部分结果表明，IRS-1是间充质干细胞成骨分化的必需因子，敲低IRS-1则TAZ表达下调，成骨分化抑制；过表达IRS-1则TAZ表达上调，成骨分化加强。
另一方面，本研究还发现了IRS-1和TAZ之间的密切联系。TAZ是调节BMSCs成骨-成脂分化平衡的关键因子。最初，TAZ作为14-3-3结合蛋白被发现，其89位丝氨酸位点磷酸化后可以与14-3-3结合，进而阻滞于细胞质[19]。TAZ在哺乳动物广泛表达，与Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)有约50%同源性，且在拓扑结构上十分相似[20]。TAZ和YAP一样具有转录激活功能，最先发现TAZ可分别与成骨分化关键转录因子RUNX2及成脂分化关键转录因子PPARγ结合，激活RUNX2转录，抑制PPARγ转录活性，从而促进成骨分化而抑制成脂分化，即调节干细胞定向分化[21]。本研究首次发现了IRS-1和TAZ之间的相互作用，这种相互作用可能是IRS-1促进BMSCs向成骨细胞分化的潜在机制。
综上所述，IRS-1可通过上调TAZ表达，促进BMSCs向成骨细胞分化。IRS-1/TAZ可能作为基因修饰干细胞治疗糖尿病骨质疏松症的新靶点。
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