肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是起源于肾实质的恶性肿瘤，简称肾癌。近年来RCC发病率逐年上升。RCC早期多无症状，近年来随着健康体检的逐渐普及，其检出率不断升高，但仍有近1/3RCC患者在初次就诊时肿瘤已经远处转移[1]。目前，临床上尚无便捷有效地评估RCC患者治疗预后的生物标记物。斯钙素( stanniocalcin，STC) 是一类糖蛋白激素，人类STC家族分为STC1和STC2[2]，STC参与机体代谢、炎症及肿瘤的发生发展等病理生理过程，Meyer等[3]研究发现RCC患者STC2高表达，并与肿瘤侵袭力性及不良预后密切相关，因而认为STC2可以作为判断肾切除术后RCC患者预后的肿瘤标志物。目前关于外周血清STC1在RCC判断其预后的文献鲜有报道。本研究旨在通过检测RCC患者外周血清中STC1基因和蛋白水平的表达差异，结合RCC患者临床病理参数和预后生存情况，初步探讨血清中STC1表达异常在判断RCC患者预后方面的临床意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2014年6月—2015年6月河北省石家庄市人民医院泌尿外科初次行手术且术后病理确诊的50例RCC患者(试验组)。所有患者术前临床病理及影像资料完整，术后进行规范的随访。50例RCC患者中，男性28例，女性22例；年龄40～79岁，中位年龄55岁。临床分期按照第8版美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)肾癌分期和2017年TNM分期系统，收集同期正常人群血清50例作为对照组，男性27例，女性23例；年龄41～78岁，中位年龄54岁。2组患者性别、年龄差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
本研究经医院伦理委员会审核通过，患者知情同意书并签署知情同意书。
1.2 实时荧光定量-聚合酶链反应(real-time polymerase chain reaction,Real-time PCR) 采集RCC患者术前清晨空腹外周血6 mL(3 mL 提取RNA，3 mL 提取血清)，同时采集健康体检者清晨空腹外周血6 mL，采用乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid, EDTA)抗凝，室温静置30 min，2 500 r/min离心10 min，然后吸取上清液备用。冻存在-80 ℃冰箱中。用Trizol试剂(Invitrogen,Carlsbad,CA)提取血清中的总RNA，引物合成序列(见表1)按照说明书，经一步RT-PCR试剂盒(全式金，北京)逆转录到cDNA上。采用SYBRGreen染料法进行实时定量PCR(ABI 7500，美国应用生物系统公司)。每个样本设3个复管，目的基因和β-actin基因在同一反应条件下进行，同时设立阴性对照。使用Roto Gene 3000软件手动操作，计算CT值，以2-△△Ct法计算2组基因表达水平差异[4]。反应体系为：SYBR Green(2X) 10 μL，正向引物0.25 μmol/L，反向引物 0.25 μmol/L，cDNA模板 1 μL，无核酸蒸馏水至20 μL。反应条件：94 ℃ 1 min，94 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。
表1 引物合成序列
Table 1 Primer synthesis sequence
目的基因产物大小序列 STC1269正向 5′-AGCAGAATGACTCTGTGAGCCC-3′ STC1反向: 5′- CGACCTGTAGAGCACTGTTGAGG-3′ β-actin253正向 5′-CAGGGCGTGATGGTGGGCA-3′ β-actin反向 5′-CAAACATCATCTGGGTCATCTTCTC-3′
1.3 酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)检测 采用 ELISA 法检测血清中 STC1的蛋白含量:参照试剂说明书加样于反应孔中后37 ℃孵育 1 h，洗板，每微孔先滴入底物Ⅰ 50 μL，再滴入底物Ⅱ 50 μL，混匀，避光反应15 min，然后滴入终止液，每孔50 μL，混匀，使反应终止;30 min 内进行检测，酶标仪设为450 nm，记录各微孔的吸光度值(optical density，OD) ，根据标准曲线的回归方程式计算 STC1的含量。
1.4 资料收集 所有患者术前进行(血细胞分析、生化等检查)、腹部超声或CT以及肺部影像学检查。术后规范性随访每例患者，每3个月回访并记录生存状态，所有患者中位随访时间为59.3 个月。生存分析采用计算患者总生存率(overall survival，OS)，即从患者手术日期到因各种原因而死亡的时间。
1.5 统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件分析数据。计量资料比较采用独立样本的t检验，计数资料比较采用χ2检验；STC1在肾细胞癌中的预后作用采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线log-rank比较两组间的差异。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 2组外周血清STC1基因(STC1mRAN)表达比较 Real-time PCR结果显示，试验组患者外周血清中STC1基因的表达明显高于对照组(1.203±0.271 vs 0.353±0.182，t=12.132，P<0.001)。
2.2 2组外周血清STC1蛋白含量的比较 ELISA结果显示，RCC患者外周血清中STC1蛋白的表达明显高于正常人群对照组(23.112±6.054 vs 12.583±4.592，t=7.792，P<0.001)。
2.3 血清STC1基因含量和临床参数的关系 进一步对50例RCC患者血清STC1含量和临床病理参数等进行了相关性分析，RCC患者血清中STC1mRNA 表达明显升高，RCC患者肿瘤组织中表达STC1变化在患者有无临床症状、不同Fuhrman分级、是否伴坏死、AJCC肾癌分期、淋巴结转移和是否远处转移方面差异有统计学意义(P<0.05)，见表2。
表2 RCC患者外周血中的STC1mRNA表达与临床病理学特征关系
Table 2 Relationship between STC1 mRNA expression in peripheral blood of renal cell carcinoma patients and the clinical pathological parameters 
因素例数STC1/β-actin mRNAt值P值性别 男性 女性28221.192±0.2611.202±0.1820.3820.940年龄(岁) <60 ≥6024261.213±0.1401.202±0.3020.3640.962症状有无 无 有31190.985±0.2361.392±0.3924.3420.012Fuhrman分级 Ⅰ～Ⅱ Ⅲ～Ⅳ32181.082±0.1941.362±0.1812.2710.024AJCC肾癌分期 Ⅰ～Ⅱ分期 Ⅲ～Ⅳ分期31191.015±0.2921.352±0.1534.1180.018坏死 无 有26241.125±0.1221.384±0.1712.2830.023淋巴转移 无 有30201.024±0.2921.415±0.2514.5210.010远处转移 无 有32181.043±0.2271.435±0.1984.5070.011
2.4 RCC患者术前血清STC1蛋白表达水平与预后关系 50例RCC患者均获随访，中位随访时间为59.3个月，随访期间17例患者因各种原因发生死亡。按外周血清中STC1表达水平的中位数分为低表达组和高表达组。采用Kaplan-Meier方法绘制生存曲线，STC1 高表达组患者总体生存明显差于低表达组患者(P<0.001)，见图1。
图1 RCC患者血清STC1蛋白低表达和高表达组术后总体生存曲线
Figure 1 Overall survival curve of RCC patients with STC1 protein low expression and high expression in renal cell carcinoma
3 讨 论
RCC的具体发病机制尚不完全清楚，研究发现RCC发生与发展受到多种基因调控，其中涉及癌基因的激活、抑癌基因的失活和增殖调节失控等多因素多环节，并通过多条信号转导通路共同起作用。缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factors，HIF)在RCC发生发展中发挥重要作用，近年来，学者高度关注一种与HIF-1α密切相关的糖蛋白激素—STC，目前研究证实内源性低氧HIF-1α是缺氧条件下诱导 STC1mRNA 表达增强的一个关键因子，STC1通过促进缺氧区域的血管生成和提高肿瘤细胞的缺氧耐受性，来维持肿瘤细胞的能量代谢、新血管形成及肿瘤增殖[2-5]。Ma 等[6]通过在RCC组织和细胞水平研究发现缺氧促进 STC1表达。Meyer等[3]研究发现RCC患者中STC2高表达，而且发现STC2高表达患者总生存期较短，得出结论STC2可作为RCC患者术后判断预后的肿瘤标记物。STC1同样在多种恶性肿瘤患者血清和肿瘤组织中异常表达，樊鑫等[7]研究发现，膀胱癌患癌组织中STC1在基因和蛋白水平均表达升高，进一步通过向体外培养膀胱癌细胞中加入外源性STC1蛋白，可见STC1可促进膀胱癌细胞的增殖、降低其凋亡，进一步的迁移实验发现外源性STC1蛋白可明显增强膀胱癌细胞的迁移能力，而Bai 等[8]研究发现STC1通过细胞周期蛋白E1(cyclin E1)/周期蛋白依赖激酶(cyclin dependent kinase 2 )通路促进前列腺癌细胞增殖，前期研究发现STC1在RCC患者癌组织中表达上调，STC1表达水平与RCC总体生存呈负相关[4]，如果术前就可以判断患者预后将临床意义更大，关于血清STC1判断RCC预后方面的研究报道较少，本研究通过检测RCC患者外周血清中STC1表达情况，研究外周血清中STC1表达水平与RCC患者临床病理参数的关系，初步探讨血清中STC1表达异常在判断RCC患者预后方面的临床意义。
众所周知，肿瘤诊断学研究的一个热点是寻找敏感度、特异度高的的肿瘤标志物不仅有助于术前诊断，也可用于肿瘤预后评估，目前尚无有效的肿瘤标记物来判断肾细胞癌预后情况。STC1异常表达与RCC预后关系成为近几年的研究热点。曾金敏等[9]研究发现RCC患者外周血STC1基因表达阳性，进而通过RCC在细胞水平研究发现不同浓度STC1影响肾癌细胞的增殖与凋亡。Ma等[6]研究发现在细胞水平STC1通过调节HIF-1α来调控RCC肿瘤细胞的增殖，并且发现RCC患者肿瘤组织在STC1基因和蛋白水平表达均显著上调，进一步抑制STC1可以抑制肾癌细胞生长迁徙和浸润侵袭，STC1可能通过促进上皮间皮变使RCC发生远处转移[10]。本研究采用Real-time PCR和ELISA法检测2组血清中STC1表达情况。结果显示，试验组患者血清中STC1在基因和蛋白水平表达均明显高于对照组(P<0.05) ，与既往文献报道STC1在各种肿瘤中表达水平上调，如肝细胞癌[11]、胃癌[12]、卵巢癌[13-14]和乳腺癌[15]和结肠癌[16]相一致。本课题组之前研究也发现RCC肿瘤组织STC1 中表达上调，提示RCC患者血清SCT1水平与癌组织中SCT1均表达升高[4]。
本研究通过检测STC1在RCC患者和正常人群血清中的表达情况，探讨 STC1与RCC患者临床病理特征的关系以及其在判断RCC患者预后中的价值。发现RCC患者外周血STC1基因高表达多见于已经出现临床症状、Fuhrman分级为Ⅲ～Ⅳ级、肿瘤伴有坏死、AJCC肾癌临床分期多为Ⅲ期和Ⅳ期和出现淋巴结转移及远处转移的患者。关于STC1与RCC临床病理变量的关系，Ma等[6]也研究发现RCC肿瘤组织中STC1的基因表达水平和RCC患者组织的Fuhrman分级和临床分期明显相关。前期研究也发现的RCC肿瘤组织中高STC1 的表达水平与RCC不良预后密切相关[4]。此外，既往也有较多文献报道了STC1在其他肿瘤中的预后作用，如Chan等[11]发现血清中STC1高表达与肝细胞癌更大的肿瘤直径和更差的5年无病生存相关；Brantley等[15]发现原发肿瘤组织中STC1的表达水平与乳腺癌晚期复发有着较强的关联，STC1的表达水平越高，乳腺癌晚期复发概率越高。由于临床分期、淋巴结转移和是否远处转移在很大程度上决定了RCC患者的预后。本研究通过分析外周血STC1表达水平与RCC患者预后的相关性，发现STC1表达水平与伴发临床症状、高Fuhrman分级和AJCC肾癌临床分期、出现淋巴结转移及远处转移等预后不良因素明显相关。本研究生存分析也证实了RCC血清中STC1的高表达者预后不良。由于血清STC1的高表达不具备组织特异性，需要结合患者病史及影像学检查综合评估。本研究为单中心回顾性研究，并且样本量较少，故需多中心大样本前瞻性临床研究进一步证实。
总之， 外周血清STC1高表达对RCC患者可能有较高的临床应用价值，有望成为RCC患者判断预后的新的肿瘤标志物。
[1] Sobotka R,Capoun O,Hanus T,et al. The importance of serum osteopontin and stanniocalcin-1 in renal cell carcinoma[J]. Neoplasma，2018,65(6):958-964.
[2] 苏世强，庞书舰，王少刚.斯钙素在肾细胞癌发病机制中的作用研究进展[J].医学研究生学报,2016,29(2):210-213.
[3] Meyer HA,Tölle A,Jung M，et al.Identification of stanniocalcin2 as prognostic marker in renal cell carcinoma[J]. Eur Urol，2009，55(3):669-678.
[4] 苏世强，刘丽哲，陈延,等.斯钙素1表达与肾细胞癌临床预后的关系[J].实用医学杂志，2020,36(3):335-339.
[5] 周丹,刘军,罗珍,等.HIF-1α和SDF-1在分化型甲状腺癌中的表达及意义[J].河北医科大学学报,2019,40(9):1063-1067.
[6] Ma X,Gu L,Li H,et al. Hypoxia-induced over expression of stanniocalcin-1 is associated with the metastasis of early stage clear cell renal cell carcinoma[J]. J Transl Med，2015,13:56.
[7] 樊鑫,师磊,宋东奎.斯钙素-1促进膀胱癌5637细胞增殖和迁移、抑制凋亡的研究[J].中华实验外科杂志，2018,35(5):936-939.
[8] Bai Y,Xiao Y,Dai Y,et al. Stanniocalcin1 promotes cell proliferation via cyclin E1/cyclin dependent kinase 2 in human prostate carcinoma[J]. Oncol Rep，2017,37(4):2465-2471.
[9] 曾金敏,周家杰,杨光华,等.肾癌患者外周血斯钙素1的表达及其对肾癌细胞增殖的影响[J].中华实验外科杂志，2016,33(6):1474-1476.
[10] 周舫,张恺,翟若南,等.NF-κB对A549细胞上皮间质转化进程的影响[J].郑州大学学报(医学版),2019,54(6):820-823.
[11] Chan KK,Leung CO,Wong CC,et al. Secretory Stanniocalcin 1 promotes metastasis of hepatocellular carcinoma through activation of JNK signaling pathway[J]. Cancer Lett,2017，403:330-338.
[12] Wang Y,Qi Z,Zhou M,et al. Stanniocalcin 1 promotes cell proliferation,chemoresistance and metastasis in hypoxic gastric cancer cells via Bcl 2[J]. Oncol Rep，2019,41(3):1998-2008.
[13] Yang Y,Yin S,Li S,et al. Stanniocalcin 1 in tumor microenvironment promotes metastasis of ovarian cancer[J]. Onco Targets Ther,2019,12:2789-2798.
[14] 王晓旭，潘文婧，冯书君,等.斯钙素及其在妇科肿瘤发生发展中的研究进展[J].现代肿瘤医学，2019,27(19):3543-3546.
[15] Brantley KD,Kjaersgaard A,Cronin-Fenton D,et al. Stanniocalcin expression as a predictor of late breast cancer recurrence[J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2018，27(6):653-659.
[16] 张健,赵素平,王宗艳,等.结肠癌组织中STC1的表达及其与肿瘤微环境的关系[J].中国病理生理杂志,2019,35(4):628-635.