心脏直视手术中体外循环(cardiopulmonary bypass,CPB)的建立导致机体发生应激和炎症反应，产生的炎性因子不仅加重心肌细胞的损伤[1]，还造成了除心脏外其他组织细胞的损伤，如术后的肺功能减退等[2]。中性粒细胞在炎症反应中发挥重要作用，作为机体防御性反应的重要标志物被大量激活，引起呼吸爆发和全身炎症反应综合征。中性粒细胞的凋亡与清除是限制炎症反应、炎症消散的重要方式，抑制其凋亡可以加重、发展炎症反应。研究证实，体外循环过程中外周血中性粒细胞数量增多，凋亡延迟和减少，导致血浆促炎症因子水平升高，其严重程度与体外循环时间及主动脉阻断时间相关[3]。中性粒细胞的蛋白表型与婴幼儿体外循环后炎症反应结果相关[4]。核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)的激活在炎症级联反应中发挥关键作用，抑制心肌NF-κB信号通路的激活可以减轻法洛四联症患儿体外循环后的全身炎症反应[5]，不同剂量的右美托咪定可以减轻体外循环心内手术患儿的全身炎症反应[6]。右美托咪定减轻体外循环患儿围术期炎症反应的作用是否与抑制中性粒细胞NF-κB活性、减轻中性粒细胞的凋亡抑制和延迟有关尚不清楚。本研究拟评价右美托咪定对体外循环心内直视手术患儿外周血中性粒细胞凋亡和NF-κB活性的影响，进一步探讨右美托咪定减轻炎症反应的机制。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2015年10月—2018年3月在河北医科大学第一医院择期CPB下行室间隔缺损修补术患儿60例，美国麻醉医师协会(American Society of Anesthesiologists，ASA)分级Ⅱ或Ⅲ级。无近期急性感染史，肝肾功能未见异常，无重度贫血及近期使用皮质激素治疗史。采用随机数字表法，将其分为2组(n=30)：对照组(C组)和右美托咪定组(D组)。2组患儿性别、年龄、体重、主动脉阻断时间和连续性血液净化时间比较差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。见表1。
表1 2组一般情况各指标的比较
Table 1 Comparison of general data between two groups 
组别性别(例数)男性女性年龄(岁)体重(kg)主动脉阻断时间(min)连续性血液净化时间(min)C组15155.2±1.419.6±4.640.7±20.258.5±20.9D组14165.3±1.320.2±5.543.7±21.767.4±22.4χ2/t值0.0670.4830.4100.2020.101P值0.5000.4900.5240.4550.751
本研究经河北医科大学第一医院医学伦理委员会批准；患儿监护人均知情同意并签署知情同意书。
1.2 麻醉方法 入室前30 min肌肉注射东莨菪碱0.01 mg/kg。肌肉注射氯胺酮4～6 mg/kg后入室，监测血压、心率和血氧饱和度，开放外周静脉通路，行桡动脉穿刺置管，持续监测MAP。麻醉诱导：静脉注射咪唑安定0.15 mg/kg，舒芬太尼1 μg/kg，依托咪酯0.3 mg/kg，罗库溴铵0.6 mg/kg诱导，气管插管后行机械通气，氧流量2 L/min，潮气量10～12 mL/kg，吸呼比1∶2，维持PETCO2 35～45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。行右颈内静脉穿刺置管。麻醉维持：间断静脉注射舒芬太尼0.5～1 μg/kg、罗库溴铵0.3～0.6 mg/kg，丙泊酚4～6 mg·kg-1·min-1持续输注。CPB采用WEL-1000人工心肺机(天津汇康医用设备有限公司)和ODMO-100型膜式氧合器(西安岱岱生物医学工程有限责任公司)。羟乙基淀粉130/0.4、压积红细胞、冷冻血浆等预充，晶胶比0.4～0.6∶1。动脉流量80～120 mL·kg-1·min-1，术中维持平均动脉压 40～60 mmHg。术毕带气管导管入ICU，待患儿苏醒、肌力恢复、血流动力学稳定后拔除气管导管，术后进行静脉镇痛，配方为舒芬太尼2 μg/kg加生理盐水稀释至100 mL，输注速率2 mL/h，维持VAS评分≤3分。
1.3 标本采集及指标检测 麻醉诱导后D组给予初始剂量0.5 μg/kg的盐酸右美托咪定注射液(批号：20131101，江苏恩华药业股份有限公司)(给药时间>10 min)，继之以0.4 μg·kg-1·h-1的速率维持至术毕，C组给予等容量生理盐水。于CPB开始前(T0)、CPB开始后30 min(T1)、CPB停止后30 min(T2)、CPB停止后4 h(T3)和CPB停止后24 h(T4)采集桡动脉血5 mL，其中3 mL肝素抗凝后，3 000 r/min离心10 min，取上层血浆，-20 ℃保存。采用Percoll密度梯度离心法分离中性粒细胞，瑞氏染色检验分离细胞的纯度，台盼兰检验细胞活性。用流式细胞仪观测中性粒细胞凋亡率和Caspase-3的表达。采用细胞核蛋白/浆蛋白抽提试剂盒(北京博凌科为生物科技有限公司)提取中性粒细胞核蛋白，BCA法进行蛋白定量。夹心酶联免疫吸附测试法(Sandwich ELISA)测定NF-κB活性，酶标仪测定450 nm处的吸光值，反映NF-κB的活性。
1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件分析数据。计量资料分别采用独立样本的t检验和重复测量的方差分析，两变量间的相互关系用直线相关分析，计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2组患儿中性粒细胞NF-κB活性在T1～4均较T0时升高(P<0.05)，D组在T1～4各时间点均低于C组，2组在组间、时点间及组间·时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)；2组患儿中性粒细胞凋亡率和Caspase-3的表达从T0到T2逐渐降低，T3、T4时升高，但均较T0时降低，D组在T1～4各时间点均高于C组，2组在组间、时点间差异均有统计学意义(P<0.05)。中性粒细胞凋亡率与NF-κB活性呈负相关(C组：r=-0.606，P<0.05；D组：r=-0.691，P<0.05)。见表2。
表2 2组中性粒细胞凋亡率、NF-κB活性和Caspase-3表达的比较
Table 2 Comparison of apoptosis rate of polymorphonuclear,NF-κB activity and express of caspase-3 between two groups
组别中性粒细胞凋亡率(%)T0T1T2T3T4C组6.28±2.603.74±1.131.77±0.733.18±1.764.68±1.76D组6.24±2.454.04±1.973.07±1.434.69±2.484.93±2.22组间F值=6.186 P值=0.016时点间F值=35.145 P值<0.001组间·时点间F值=2.112 P值=0.080 组别NF-κB活性T0T1T2T3T4C组0.57±0.251.10±0.211.39±0.351.08±0.340.86±0.19D组0.55±0.290.72±0.210.87±0.340.79±0.320.73±0.24组间F值=56.553 P值<0.001时点间F值=35.739 P值<0.001组间·时点间F值=8.001 P值<0.001 组别Caspase-3表达T0T1T2T3T4C组18.80±6.4011.75±3.385.44±2.266.72±2.499.97±3.56D组19.87±4.6112.20±2.348.35±2.219.96±3.1410.14±3.12组间F值=14.459 P值<0.001时点间F值=111.393 P值<0.001组间·时点间F值=2.359 P值=0.054
3 讨 论
中性粒细胞的大量激活是各种原因导致全身炎症反应和严重的炎症性疾病进展过程的重要环节。中性粒细胞被激活后可释放蛋白水解酶和大量的氧自由基及各种炎症介质，造成正常组织细胞的损伤。作为终末分化细胞的中性粒细胞凋亡被抑制时，各种炎症介质和毒性物质释放增多，导致炎症反应加剧[7-9]。体外循环过程中的各种应激因素导致中性粒细胞被大量激活，引起的全身炎症反应与中性粒细胞凋亡延迟相关。本研究结果也显示，随着CPB的进行，中性粒细胞凋亡率降低，在CPB停止后的30 min达最低。
NF-κB是一个重要的转录调节因子，是细胞凋亡过程中重要的调节因素。NF-κB的活化是中性粒细胞凋亡抑制的重要机制之一，在各种急性炎症反应过程中发挥重要的调节作用。一些感染性疾病中NF-κB的活化导致中性粒细胞凋亡延迟，造成扩散机体组织功能的损伤[10]。NF-κB活化抑制中性粒细胞凋亡的机制包括NF-κB活化促进IL-8、IL-1β和TNF-α等炎性因子的释放及上调抗凋亡蛋白Bcl-2、Mcl-1的表达，通过调节线粒体途径抑制中性粒细胞的凋亡，调节细胞表面死亡受体的表达，抑制Caspase级联反应等，从而抑制中性粒细胞的凋亡[9,11-12]。采用间充质干细胞治疗或其他药物抑制NF-κB活化，改善炎症反应中性粒细胞凋亡被抑制的状态，减轻脂多糖和内毒素所致的急性肺损伤[13-14]。本研究结果显示，随着CPB的进行，2组患儿NF-κB活性升高，中性粒细胞凋亡率降低，Caspase-3的表达降低，在CPB停止后30min时达最低值，且中性粒细胞凋亡率与NF-κB活性呈负相关，说明在体外循环过程中外周血中性粒细胞NF-κB的活化可能与中性粒细胞的凋亡减少和延迟有关。
右美托咪定作为全身麻醉的辅助用药，有利于术中血流动力学的平稳，并通过抑制围术期应激反应和血浆炎症因子的释放，减轻体外循环手术过程中及术后的全身炎症反应及缺血再灌注损伤，保护心脏及其他重要脏器的功能[15-16]，研究表明这些作用的机制可能与抑制外周血单核细胞NF-κB信号通路的激活有关[17-18]。右美托咪定通过激活α2肾上腺素能受体抑制中性粒细胞趋化因子的产生及白细胞与内皮细胞的黏附作用[19]，减少中性粒细胞在组织器官的集聚，减少TNF-α和IL-6等炎症因子的产生，减轻炎症反应，在围术期发挥器官保护作用[20]。右美托咪定可以减少大肠杆菌刺激产生的中性粒细胞呼吸爆发作用，这对减轻应激状态下的全身炎症反应综合征具有积极意义。同时研究证实，右美托咪定在各种应激状态下对不同脏器的保护功能与抑制NF-κB信号通路的作用有关[21-23]。本研究结果显示，与对照组相比，右美托咪定组在CPB过程及停止后的各时间点中性粒细胞NF-κB活性降低，T2、T3时中性粒细胞细胞凋亡率明显升高，Caspase-3的表达升高。Caspase-3是细胞凋亡死亡受体途径和线粒体途径信号转导最终的共同通路，说明右美托咪定减轻了体外循环的中性粒细胞凋亡抑制，其可能与抑制NF-κB的活性有关。
综上所述，NF-κB活性的抑制参与了右美托咪定减轻体外循环手术患儿外周血中性粒细胞凋亡抑制的过程，可能是其减轻体外循环手术患儿围术期炎症反应的作用机制之一。
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