糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)作为一种内分泌疾病，是糖尿病中最常见且严重的并发症之一。当前全球大约有2/5的糖尿病患者会发生严重的DN并发症[1]。在疾病末期，DN患者出现肾衰竭，最终导致死亡[2]。DN病理损伤过程中，肾小球及肾小管发生增生、肥大，炎性细胞浸润以及肾小球系膜细胞损伤等病理性改变，导致尿液中出现蛋白、尿液减少等临床症状。近年来研究者提出“微炎症”学说，认为DN是由炎症引起的代谢紊乱性疾病，高炎症被认为是DN的显著特点[3]。在高糖微环境中，核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)信号通话的激活被认为在促炎环境中起到至关重要的作用。MicroRNAs(miRNAs)作为一种非编码短链微小RNA，对靶基因表达具有调控作用。MicroRNAs在肾脏疾病中起到何种作用，是一个备受关注的研究热点。在DN发展过程中，MicroRNAs调节炎症的作用机制尚不清楚。姜黄素具有抗炎[4]、抗氧化[5]和降血糖[6]等作用。本研究课题通过构建大鼠DN动物模型，观察姜黄素对miR-146a mRNA表达的影响，探讨姜黄素在DN中缓解肾脏损伤的机制研究，为临床治疗DN提供新思路。
1 材料与方法
1.1 材料来源 体重220 g左右的雄性SD大鼠(河北省实验动物中心购买，合格证编号：1808247)；链脲佐菌素、姜黄素(美国 Sigma公司)；尿蛋白测定试剂盒(上海生工生物有限公司)；Nephrin兔抗鼠单抗、NF-κB p65兔抗鼠单抗(美国Abcam公司)；Trizol RNA抽提试剂、Real-time ScriptTM逆转录试剂盒、SYBR Premix ExTaTM荧光实时定量聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)试剂盒(广州锐博技术有限公司)；Western blot制胶试剂盒(碧云天生物公司)；全自动生化分析仪(美国贝克曼公司)； Nanodrop ND-2000(美国Thermo公司)；7500 Fast型荧光实时定量PCR仪(美国ABI公司)；莱卡正置荧光显微镜(德国莱卡公司)；蛋白印迹试验装置(美国Bio-Rad公司)。本实验所用引物均由广州锐博技术有限公司合成。将SD大鼠分为：空白对照组(N组)：无需任何处理；糖尿病肾病模型组(DN组)：仅建立DN动物模型；姜黄素干预治疗组(CT组)：在建立DN动物模型基础上，每天姜黄素悬液灌胃(500 mg/kg)，干预治疗持续4周。N组和DN组每天用PBS进行灌胃干预治疗，持续4周。
1.2 方法
1.2.1 大鼠DN模型的制备[7] 给予SD大鼠高脂、高糖饲料喂养。连续高脂、高糖喂养6周后，每只SD大鼠按照30 mg/kg 腹腔注射1% 链脲佐菌素(streptozocin，STZ)，腹腔连续注射1周。继续给予高脂、高糖饲料喂养4周，利用代谢笼收集24 h大鼠尿液。满足以下条件：①24 h尿蛋白≥0.4 mg；②随机血糖≥16.7 mmol/L，才能确认DN大鼠动物模型建模成功。
1.2.2 大鼠生化指标检测 利用代谢笼收集各组大鼠24 h尿液，室温条件下静置10 min，以3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，随后按照试剂盒说明书进行上机操作，检测尿蛋白。用2%戊巴比妥钠麻醉大鼠，开腹后从腹主动脉获取血清，利用全自动生化分析仪测定血糖(blood glucose，BG)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，SCr)和尿白蛋白肌酐比值(urine albumin creatine ratio，UACR)等生化指标。
1.2.3 肾组织病理学观察 处死大鼠，将肾脏组织放置10% 甲醛溶液中固定，然后经石蜡包埋、切片、脱蜡、水化、抗原修复、苏木素染色、脱水干燥等一系列过程，最后中性树脂封片，镜下观察。
1.2.4 肾组织Nephrin蛋白变化情况 将各组大鼠肾脏组织去除筋膜后液氮冷冻研磨，将预冷的蛋白裂解液加入到研钵中提取蛋白并进行蛋白浓度测定。随后将蛋白样品进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)电泳分离，再以恒流电转印到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，室温条件下封闭1 h，再加入相应抗体，4 ℃孵育过夜，次日用1×TBS-T液洗涤3次，10 min/次，加入辣根酶标记的二抗，37 ℃孵育1 h，1×TBS-T液洗涤3次，10 min/次，ECL化学发光剂检测蛋白表达情况。
1.2.5 miR-146a、促炎因子[肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor- α，TNF-α)和白细胞介素1β(interleukin-1β，IL-1β)]及纤维化因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)、Ⅰ型胶原蛋白(collagenⅠ)基因表达情况 干预治疗4周后，处死大鼠，将肾脏组织去除筋膜后液氮冷冻研磨，随后加入1 mL TRIzol试剂，小心吹吸后移入去酶EP管中，按照TRIzol试剂盒使用说明提取组织总RNA。Nanodrop ND-2000检测RNA质量和浓度。随后将提取的RNA反转录为cDNA，取cDNA进行荧光实时定量PCR检测，PCR反应条件按照广州锐博试剂说明书进行操作。实验数据通过相对定量△△Ct法进行分析。
1.3 细胞水平研究
1.3.1 大鼠肾小球系膜细胞(mesangial cells，HBZY-1)培养 分别在含有4.5 mmol/L 和25 mmol/L葡萄糖的含10%牛清的细胞培养液条件下培养HBZY-1细胞，用于模拟正常生理环境和糖尿病高糖环境。
1.3.2 不同培养条件下检测miR-146a基因表达情况 在正常培养条件下，分别用0、5 μmol/L、15 μmol/L和25 μmol/L浓度姜黄素刺激HBZY-1细胞24 h后，收集细胞检测miR-146a基因表达；分别在含有4.5 mmol/L(L-HC组)、15 mmol/L(M-HC组)和25 mmol/L葡萄糖(H-HC组)的含10%牛清的 DMEM 培养液条件下,收集细胞检测miR-146a基因表达。
1.3.3 转染miR-146a minics后各项指标检测 在含有25 mmol/L葡萄糖培养条件下，待HBZY-1细胞达到 50%～70%的汇合率后，按照说明书要求将miR-146a minics进行转染。转染成功后，荧光实时定量PCR检测miR-146a基因、靶基因Traf6和促炎因子、纤维化因子的表达情况；Western blot检测p65蛋白变化。
1.4 统计学方法 应用SPSS 21.0统计软件分析数据。计量资料比较采用单因素方差分析和SNK-q检验，以上实验均重复3次。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 生化指标和蛋白尿检测情况 留取各组大鼠血清标本和24 h尿液，利用试剂盒检测BG、BUN、SCr和UACR含量。与N组比较，DN组BG、BUN、SCr和UACR均明显升高，差异有统计学意义；CT组BG、BUN、SCr和UACR含量下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。
表1 各组大鼠血清BG、BUN、SCR水平及UACR水平比较
Table 1 Comparison of BG,BUN,SCR and UACR among different groups 
组别BG(mmol/L)BUN(mmol/L)SCr(mmol/L)UACR(mg/mmol)N组5.59±1.239.72±2.0873.47±7.2840.51±3.07DN组27.89±2.94*19.78±3.73*201.40±10.19*235.98±12.74*CT组19.77±1.86#14.16±2.77#142.29±11.27#180.52±11.06# F值331.90395.191566.234267.236 P值<0.001<0.001<0.001<0.001
*P值<0.05与N组比较 #P值<0.05 与DN组比较(SNK-q检验)
2.2 各组大鼠病理切片情况 N组大鼠肾脏组织形态规则、结构清晰；DN组大鼠肾脏组织可见大量炎细胞浸润，肾小管胞质呈空泡状；CT组肾脏结构清晰，水肿消退，肾脏组织损伤缓解。见图1。
图1 各组大鼠肾脏组织HE染色( ×200)
A.D组；B.DN组；C.CT组
Figure 1 HE staining of rat kidney tissue in each group( ×200)
2.3 各组大鼠组织Nephrin蛋白和炎症因子、纤维化因子表达情况 Western blot结果显示，与N组比较，DN组Nephrin蛋白表达降低；而与DN组相比，CT组Nephrin蛋白表达则升高，差异有统计学意义(P<0.05)。实时定量PCR结果显示，与N组比较，DN组miR-146a表达降低，促炎因子TNF-α、IL-1β和纤维化因子TGF-β、collagen Ⅰ表达升高；而与DN组比较，CT组miR-146a表达则升高，细胞因子表达则降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2，表2。
图2 各组大鼠组织Nephrin表达情况
Figure 2 Nephrin protein expression in rat tissues of each group
2.4 不同培养条件下miR-146a基因表达情况 在含有4.5 mmol/L葡糖糖培养条件下，随着姜黄素浓度增加，miR-146a基因表达增加，呈剂量依赖性；在含有不同糖浓度培养条件下，随着糖含量增加，miR-146a mRNA表达降低，呈剂量依赖性。见表3，4。
2.5 转染miR-146a minics对miR146a和细胞因子表达的影响 将miR-146a minics和 negative control(NC)转染到高糖培养条件下HBZY-1细胞中，转染miR-146a minics的H-HC miR-146a组中， miR-146a的表达明显高于H-HC miR-NC组，而H-HC组与H-HC miR-NC组之间差异无统计学意义；与H-HC miR-NC组比较，H-HC miR-146a组中靶基因Traf6和促炎因子(TNF-α和IL-1β)、促纤维化因子(TGF-β和collagen Ⅰ)均降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5。
表2 各组大鼠组织miR-146a mRNA及细胞因子表达情况比较
Table 2 miR-146a mRNA and cytokine expression in rat tissues of each group
组别miR-146aTNF-αIL-1βTGF-βcollagen IN组 0.99±0.171.05±0.280.99±0.210.99±0.181.05±0.28DN组0.41±0.06*7.36±1.33*6.41±2.32*12.06±1.69*7.31±2.09*CT组0.82±0.35#3.47±0.96#3.04±0.93#6.79±1.29#2.15±0.82#F值61.850371.200184.600399.600340.100P值<0.001<0.001<0.001<0.001<0.001
*P值<0.05与N组比较 #P<0.05与DN组比较(SNK-q检验)
表3 不同姜黄素培养条件下miR-146a mRNA
表达情况比较
Table 3 miR-146a mRNA expression under different
curcumin culture
组别 miR-146a姜黄素0 μmol/L组 1.06±0.32 姜黄素5 μmol/L组 1.91±0.48*姜黄素15 μmol/L组4.01±1.09*姜黄素20 μmol/L组7.17±1.32*F值 389.300P值 <0.001
*P值<0.05与姜黄素0 μmol/L组比较(SNK-q检验)
表4 不同葡萄糖培养条件下miR-146a mRNA
表达情况比较
Table 4 miR-146a mRNA expression under different
glucose culture
组别 miR-146a葡萄糖4.5 mmol/L组1.03±0.11 葡萄糖15 mmol/L组 0.54±0.16*葡萄糖25 mmol/L组 0.35±0.09*F值 95.870P值 <0.001
*P<0.05与葡萄糖4.5 mmol/L组比较(SNK-q检验)
表5 转染后各组细胞中mRNA表达情况比较
Table 5 After transfection,mRNA expression in cells of each group
组别miR-146aTraf6TNF-αIL-1βTGF-βcollagen IH-HC组0.99±0.111.01±0.351.12±0.141.02±0.361.01±0.291.04±0.14H-HC miR-NC组1.03±0.131.06±0.220.97±0.160.88±0.251.05±0.261.02±0.38H-HC miR-146a组6.38±1.27*0.36±0.08*0.47±0.02*0.46±0.17*0.31±0.07*0.43±0.18* F值489.70033.44021.24029.27033.83031.390 P值<0.001<0.001<0.005<0.001<0.001<0.001
*P值<0.05 与H-HC miR-NC组比较(SNK-q检验)
2.6 miR146a对NF-κB p65活化的影响 在高糖条件培养下的HBZY-1转染miR-146a minics和negative control后，H-HC miR-146a组中p65蛋白表达水平明显低于H-HC miR-NC组和H-HC组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3 。
图3 各组细胞中p65表达水平情况
Figure 3 p65 protein expression in cells of each group
3 讨 论
DN是机体代谢紊乱损伤微血管的一种内分泌疾病。在高糖内环境下，DN患者的肾小球系膜细胞发生增殖、坏死，间质纤维化，导致肾功能损伤，最终发展为肾衰竭[8-9]。炎症因子在DN发展中起到至关重要的作用，是DN主要发病机制之一[10-12]。尿液中出现含有微量白蛋白标志着肾脏出现损伤，肾功能下降。因此，蛋白尿可作为DN进展的主要指证之一[13]。临床上主要以降低血糖及控制炎症为主的治疗方案，减少蛋白尿改善DN患者的临床症状。姜黄素属于植物姜黄的主要成分之一，具有抑制促炎因子[4]、清除氧自由基[5]和控制血糖[6]等功能。本研究课题利用STZ诱导构建DN大鼠模型[7]，发现DN组BG、BUN、SCr和UACR含量明显高于N组，同时肾脏组织病理切片和Western blot检测Nephrin蛋白水平，提示肾脏组织损伤。而当利用姜黄素悬液干预治疗DN大鼠，大鼠的BG、BUN、SCr和UACR含量明显降低，肾脏损伤减轻或缓解，这表明姜黄素能够缓解DN的肾脏损伤，从而肾功能得到改善。
微小RNA即MicroRNA，是广泛分布在真核生物中的一类非编码小RNA[14]。通过与靶基因信使RNA碱基配对实现降解信使RNA 或抑制信使RNA的翻译表达，从而对靶基因表达进行调控[15]。人体内大约有3/5的编码蛋白质可以通过MicroRNA进行调节，人类疾病的发生与MicroRNA表达的异常有着十分关键的联系。miRNA-146a与炎症性、纤维化性疾病具有一定相关性[16-17]。体外研究发现，miR-146a mRNA表达与姜黄素、葡萄糖浓度呈剂量依赖性关系，姜黄素浓度越高，miR-146a相对表达量越高；而葡萄糖浓度越高，miR-146a 相对表达量越低。
miR-146a靶基因有Traf6和Irak1两种基因，其可以通过调控靶基因表达来影响下游基因的表达[18]。在体外高糖培养大鼠肾小球系膜细胞，利用转染技术将miR-146a mimics转染进细胞中，人为上调miR-146a表达，检测靶基因Traf6及其下游的NF-κB信号通路情况。发现，miR-146a mimics可以抑制靶基因Traf6 mRNA表达，同时其下游的NF-κB p65蛋白活性被抑制。NF-κB参与众多炎症信号通路，负责调控炎症基因表达。炎症因子异常表达在DN的发生发展中发挥了关键性作用。TNF-α和IL-1β可以导致肾脏系膜增生，肾脏纤维化[19]。在DN炎症反应中，NF-κB信号通路对其下游炎症因子是否具有调控呢？结果显示，随着人为上调miR-146a基因表达，NF-κB p65蛋白表达降低，活性被抑制，有效的抑制其下游因子TNF-α和IL-1β等基因mRNA表达。
综上所述，在DN发展过程中，姜黄素可以通过上调miRNA-146a mRNA表达，靶向调控Traf6抑制NF-κB 介导的促炎因子mRNA表达，一定程度上缓解DN大鼠肾脏损伤，改善肾脏功能，为临床治疗糖尿病肾病提供一定的基础理论。
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