新生儿窒息是围产期常见疾病，也是新生儿科收治主要病种之一，新生儿窒息后脑损伤可导致神经系统后遗症、残疾，甚至死亡[1-5]。因此，早期预测新生儿脑损伤显得尤为重要。近年来，国内新生儿脑损伤的诊断和评估仍主要依据脑电图、头颅影像学检查(MRI或CT)、颅脑彩色超声等，但这些手段存在滞后性，重症、需呼吸机辅助呼吸、生命体征不稳定、不宜搬动者无法及时行头颅MRI或CT检查，且CT辐射量大、不能床旁检查；颅脑彩色超声可床旁检查，但对矢状旁区损伤不敏感；近些年新兴起的新生儿振幅整合脑电图(amplitude integrated electroencephalogram,aEEG)检查便捷、经济，可床旁长时间监测脑功能，但许多基层医院尚未配备此类设备，从而错过最佳治疗时间窗，遗留脑瘫或精神发育迟缓等神经系统后遗症[6-7]。新生儿脑损伤受多种因素影响，近年来研究提出的有钙结合蛋白S100β、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、血清脑钠肽、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)等。S100β水平与缺氧缺血性脑病、脑白质损伤等具有相关性，且与窒息程度呈正相关[8-10]；中枢神经系统疾病患者体液中GFAP水平增高，GFAP水平可作为判断脑损伤病情的特异性标志物。S100β、GFAP都属于神经特异性蛋白，在中枢神经系统损伤修复以及发育过程中发挥了重要的作用。目前国内S100β、GFAP检测对新生儿脑损伤预测意义的研究报道尚少。本研究通过检测不同程度窒息新生儿血清中S100β、GFAP水平的变化，以期为早期预测脑损伤提供新思路和观点，减少新生儿脑损伤的不良结局。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取2019年3—10月于我院出生的新生儿100例。其中，轻度窒息新生儿(轻度窒息组)38例、重度窒息新生儿(重度窒息组)16例、无窒息史及心血管系统疾病的正常新生儿(对照组)46例。轻度窒息组男性20例，女性18例，胎龄(37.5±2.5)周，出生体重(2 806±319)g；剖宫产18例，顺产20例；入院日龄0.5～1.5 d；重度窒息组男性8例，女性8例，胎龄(37.6±2.1)周，出生体重(2 799±290)g；剖宫产6例，顺产10例；入院日龄0.5～1 d；对照组男性23例，女性23例，胎龄(38.2±1.2)周，出生体重(2 810±291)g；剖宫产31例，顺产15例；入院日龄0.5～3 d。3组新生儿性别、胎龄、出生体重、分娩方式、日龄差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
本研究符合伦理学标准，经医院伦理委员会审核批准通过，所有家属均知情同意并签署知情同意书。
纳入标准：孕母无并发症或内科疾病，新生儿性别不限。排除标准：先天性畸形、先天性脑发育异常、颅内感染、有严重并发症等新生儿。
1.2 诊断标准 窒息诊断标准及分度参照2016年新生儿窒息诊断的专家共识[11]，①产前有可能导致窒息的高危因素；②1 min或5 min Apgar评分<7分，仍未建立有效自主呼吸；③脐动脉血气分析pH<7.15；④排除其他引起低阿氏评分的病因。②～④为必要条件，①为参考指标。根据“双轨制”窒息分度标准：①轻度窒息，1 min或5 min阿氏评分<7分，脐动脉血气分析pH<7.2；②重度窒息，1 min或5 min阿氏评分<5分，脐动脉血气分析pH<7.0。
新生儿脑损伤，主要包括新生儿缺氧缺血性脑病、早产儿脑损伤(脑室周围-脑室内出血、脑室周围白质软化)。参照2015年中华医学会儿科学分会新生儿学组制定的新生儿缺氧缺血性脑病诊断标准、2012年中国医师协会新生儿专业委员会早产儿脑损伤诊断与防治专家共识，①有可引起脑损伤的高危因素；②神经系统异常临床表现；③影像学检查；④脑功能监测；⑤除外其他原因引起的脑损害。54例窒息新生儿中18例出生后出现易激惹、肌张力高、抖动、昏迷、抽搐等表现，生后3～5 d行头颅MRI、头颅CT或颅脑彩色超声检查,其中发现颅内出血和(或)新生儿缺氧缺血性脑病18例(轻度窒息10例,重度窒息8例)。分为脑损伤组18例、非脑损伤组36例。
1.3 指标标测 所有新生儿在出生后4 h内取外周静脉血2～3 mL，采血时避免溶血。采用双抗二步夹心法酶联免疫吸附试验检测S100β和GFAP水平。往包被微孔中依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，用TMB显色，TMB在过氧化物酶及酸的作用下先后转化为蓝色、黄色。用酶标仪在450 nm波长测定吸光度，计算样品水平。试剂盒均由福建省艾迪康医学检验中心提供。所有操作均由同一人严格按照试剂盒步骤执行。
窒息新生儿3 d后进行20项行为神经测查方法(neonatal behavioral neurological assessment,NBNA)，分为行为能力(6项)、被动肌张力(4项)、主动肌张力(4项)、原始反射(3项)、一般估价(3项)5个部分。每项评分分3个分度：0分、1分、2分，满分40分，35分以下为异常。
1.4 统计学方法 应用SPSS 24.0统计软件处理数据。计量资料比较采用t检验、单因素方差分析和SNK-q检验，相关性分析采用Spearman法，影响因素确定采用二元Logistic回归分析，采用ROC曲线分析S100β、GFAP对评估新生儿脑损伤的诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 各组新生儿血清S100β、GFAP检测比较 轻度窒息组、重度窒息组S100β水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；轻度窒息组与重度窒息组S100β水平差异无统计学意义(P>0.05)，3组GFAP水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。
表1 3组S100β、GFAP水平比较
Table 1 Comparison of S100β and GFAP contents
among three groups 
组别 例数S100β GFAP 对照组 461.10±0.33 2.07±0.72轻度窒息组381.55±0.48*2.23±0.65重度窒息组161.68±0.47*2.26±0.72F值 17.068 0.777 P值 <0.0010.463
*P值<0.05与对照组比较(SNK-q检验)
2.2 脑损伤组和非脑损伤组S100β、GFAP水平及NBNA评分比较 脑损伤组S100β水平明显高于非脑损伤组，NBNA评分低于非脑损伤组，差异有统计学意义(P<0.05)；脑损伤组与非脑损伤组GFAP水平差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 脑损伤组与非脑损伤组S100β、GFAP水平及
NBNA评分比较
Table 2 Comparison of S100β, GFAP and NBNA score
between the brain injury group and the non-brain
injury group in asphyxia newborn 
组别 例数S100β(μg/L)GFAP(μg/L)NBNA评分(分)非脑损伤组361.44±0.332.21±0.6535.14±3.02脑损伤组 181.87±0.602.29±0.7131.83±4.89t值 3.4130.4353.063P值 0.0010.6650.003
2.3 S100β、GFAP与NBNA评分相关性分析 Spearman相关分析结果显示，S100β水平与NBNA评分呈负相关(rs=-0.306,P<0.05)，GFAP水平与NBNA评分无相关(rs=0.032,P>0.05)。
2.4 Logistic回归分析 以颅脑损伤(否=0，是=1)为因变量，以S100β(连续型变量)、GFAP(连续型变量)为自变量，进行二元Logistic回归分析，结果显示，S100β是新生儿脑损伤的影响因素(P<0.05)。见表3。
2.5 S100β、GFAP对评估脑损伤的价值分析 绘制ROC曲线(图1)，S100β评估脑损伤的AUC=0.755(95%CI：0.603～0.907)，根据约登指数0.556，找出阳性临界值为1.595 μg/L，其诊断敏感度为77.8%，特异度为77.8%。GFAP的ROC曲线的AUC=0.488(95%CI：0.315～0.660)，根据约登指数0.139，找出阳性临界值为3.120 μg/L，其诊断敏感度为16.7%，特异度为97.2%。见表4。
表3 S100β、GFAP对脑损伤影响的二元Logistic回归分析
Table 3 Binary Logistic regression analysis of effects of S100β and GFAP on brain injury
变量标准误标准回归系统Wals χ2值P值OR值95%CIS100β2.6701.0276.7570.00914.4381.929～108.083GFAP0.1950.4410.1950.6591.2150.512～2.887
表4 S100β、GFAP水平对评估脑损伤的价值分析
Table 4 Value analysis of S100β and GFAP Levels
in evaluation of brain injury
因子敏感度特异度 AUCP值95%CIS100β77.8%77.8%0.7550.0020.603～0.907GFAP16.7%97.2%0.4880.8830.315～0.660
图1 脑损伤窒息新生儿S100β、GFAP检测的ROC曲线分析
Figure 1 ROC curve analysis of calcium binding protein S100β and serum GFAP in neonates with brain injury asphyxia
3 讨 论
新生儿脑损伤临床多隐匿或不典型，表现为易激惹、抖动、嗜睡、肌张力增高或低下、抽搐等，严重者可遗留脑瘫、运动姿势发育异常、智力低下、认知障碍、癫痫、视听感官障碍等神经系统后遗症。因新生儿脑损伤早期缺乏典型的临床表征，且相关辅助检查，如颅脑MRI/CT/彩色超声、脑电图等存在检查滞后性，且相当一部分基层医院配备不完善，故对临床医生来说，疾病早期检测脑损伤标记物有利于脑损伤的判断。
近年来，S100β在围产儿脑损伤中的应用和研究得到国内外学者的广泛关注。S100是从牛脑组织中分离出来的一种亚细胞组分，是能与钙相结合的蛋白[12]。S100β蛋白是其主要成分之一，主要集中于中枢神经系统的星形胶质细胞(astrocytes,AS)、垂体前叶细胞[13]，并在非神经细胞中少量表达。中枢神经系统损伤时，在许多体液(如脑脊液、血液、尿液、羊水)中均可测得。虽然脑外组织中存在S100β，但血液S100β主要还是来自于血脑脊液屏障破坏后脑脊液S100β的外渗[14-15]。Winter等[16]提出，S100β穿透性较强，新生儿血脑屏障薄弱。脑损伤发生时，AS细胞的细胞膜被破坏，释放S100β进入脑脊液，经血脑屏障进入血液，血清S100β水平快速升高[17]。研究表明，脑损伤可引起脑脊液和血清S100β水平显著升高[18-19]。因S100β蛋白在多种体液中可测得，采集标本方便，对脑损伤诊断的敏感度及特异度均较高，故具有早期诊断价值。
本研究结果显示，轻度窒息组和重度窒息组S100β水平高于对照组；脑损伤组S100β水平高于非脑损伤组；Spearman相关分析显示，S100β水平与NBNA评分呈负相关；回归分析显示，S100β是新生儿脑损伤的影响因素，S100β高一个单位患儿出现脑损伤的可能性高14.43倍；S100β预测脑损伤的阳性临界值为1.595 μg/L，敏感度为77.8%，特异度为77.8%。受窒息缺氧、缺血的影响，AS发生异常变化，S100β水平迅速升高，本研究标本均来源于出生4 h内外周血，提示在脑损伤早期4 h内，血清S100β变化就可被检测出来，其单独检测具有很高的准确度、敏感度及特异度。本研究结果显示，轻度窒息组与重度窒息组S100β差异无统计学意义，考虑与S100β半衰期短(2 h左右)及轻微脑损伤者病情不再进展有关。
本研究结果显示，脑损伤组NBNA评分较低，非脑损伤组NBNA评分较高。Spearman相关分析显示，S100β水平与NBNA评分呈负相关，S100β水平越高，NBNA评分越低。若患儿神经系统损伤严重，可严重影响日后生活质量，故外周血S100β早期检测对新生儿脑损伤的判断和防治具有十分重要的临床意义。
GFAP是AS细胞骨架蛋白的特有成分，是其特征性标记物[20]。AS细胞死亡后，透过血脑屏障进入血液，与神经系统损伤及修复有关[21]。潘奇峰[22]研究发现，新生儿缺氧缺血性脑病、脑室周围白质软化疾病与AS细胞数量增多有密切关系。在缺氧缺血条件下，AS细胞从静息态转变为活化态，通过神经生长因子、5-羟色胺受体等调控后分泌GFAP入血，使血中AS细胞增多，以稳定缺血组织形态的完整。中枢神经系统创伤或炎症后，GFAP 表达增加，其体液浓度是评估AS细胞增多症、AS细胞激活的重要手段，可间接反映脑损伤的程度，神经损伤越严重，浓度越高[23]。本研究结果显示，对照组、轻度窒息组、重度窒息组GFAP差异无统计学意义；GFAP与NBNA无相关性；GFAP预测脑损伤的敏感度为16.7%，特异度为97.2%。高玉松等[20]研究表明，颅脑损伤后1 h血清GFAP升高，20 h到达峰值，随着受损AS细胞数量衰亡、释放GFAP逐渐减少，释放入血的GFAP逐渐减少，若颅脑损伤12～24 h内检测GFAP正常者可排除脑损伤。张丽勇等[24]研究大鼠原发性脑干损伤模型，结果表明，脑干损伤30 min后，GFAP开始增加，损伤后48 h达到峰值并开始降低，GFAP表达具有明显规律性。本研究GFAP的检测结果表示敏感度低，但特异性高，单独检测预测脑损伤准确性不高，考虑以下几点：①本研究标本于出生后4 h内采集，窒息缺氧、缺血早期，AS细胞尚未凋亡，分泌GFAP不足，采集标本时外周血中GFAP尚未达峰值，阳性检出率低，提示此类窒息缺氧的新生儿，可考虑出生后12～24 h，一般不超过2 d，再采集GFAP检测，本研究结果对于临床医生关于采集时间的选择具有一定临床意义；②中枢神经系统受损时，GFAP从损伤的AS细胞中溢出，经过细胞间隙，透过血脑屏障进入血液，从而外周血GFAP水平升高，外周血GFAP的检出时间相对于脑脊液来说，前者滞后于后者，提示临床医生，在窒息缺氧早期，若能采集脑脊液进行GFAP检测，可能会提高敏感度；③通过ROC曲线分析，GAFP检测敏感度低，阳性检出率低，但其特异度高，若能检测到浓度升高，有一定临床意义；④样本量少，仍需在日后此类研究中扩展样本量，进一步增加数据准确度。
综上所述, 血清S100β是一种高敏感度、高特异度、高准确度的脑损伤生化标志物，有助于新生儿窒息的诊断和判断新生儿窒息后的脑部进展和结局,为预测新生儿脑损伤提供了客观依据。GFAP在生后4 h内检测准确性低，但对脑损伤的特异度高，不建议太早检测。S100β、GFAP均为脑损伤血清学标志物，在采集时间上，临床医生要考虑其动态变化规律，选择适宜的采集时间，以提高诊断的准确性，为早期预测新生儿脑细胞代谢异常提供客观依据。但由于本研究的时间及样本量有限，可能与实际有一定的偏差，且未能跟踪随访进一步研究。因此有待更大样本量及长期随访研究来证实。
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