急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)具有发病率高、致死率高的特点[1-2]。近年来，经皮冠状动脉介入术(percutaneous coronary intervention，PCI)广泛应用，ACS预后已明显改善[3]，但仍有主要不良心血管事件(major adverse cardiovascular events，MACE)发生[4-5]。MiR-326参与缺血缺氧性脑损伤[6]、胃癌[7]、宫颈癌[8]和肝细胞肝癌[9]等疾病进展，但与ACS预后的关系鲜有报道。去整合素-金属蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17)是miR-326的靶点[10]，已被证实与动脉粥样硬化有关[11]。笔者推测检测miR-326或可预测ACS预后，本研究分析miR-326与ACS预后的关系。
1 资料与方法
1.1 一般资料 前瞻性选取2016年4月—2017年3月在首都医科大学附属北京潞河医院就诊的ACS患者205例作为研究对象。根据《急性冠脉综合征急诊快速诊疗指南》[12]诊断ACS。其中男性144例，女性61例，年龄28～78岁，平均(56.17±9.37)岁，体重指数(body mass index，BMI)6.59±3.01；其中ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevation myocardial infarction，STEMI)50例，非ST段抬高型心肌梗死(non-ST elevation myocardial infarction，NSTEMI)106例，不稳定型心绞痛(unstable angina，UA)49例。纳入标准：①首次确诊为ACS并接受PCI治疗；②发病48 h内入院；③年龄<80岁。排除标准：①合并下肢动脉疾病、慢性阻塞性肺疾病、高同型半胱氨酸血症、卒中、自身免疫性疾病等；②有PCI治疗禁忌证或不接受PCI治疗；③心瓣膜病、扩张性心肌病、胸主动脉瘤；④严重肝、肾功能异常；⑤恶性肿瘤。
本研究所有受试者均签署了知情同意书，本研究经首都医科大学附属北京潞河医院医学伦理委员会批准。
1.2 外周血单个核细胞中miR-326水平检测 抽取ACS患者入院24 h内、PCI后3 d、7 d空腹肘部静脉血，采用密度梯度离心法[13]获取外周血中单个核细胞。步骤如下：25 ℃下以800 r/min转速离心15 min，离心半径为8 cm；取离心后下层沉淀物置入Ficoll分离液中获取单个核细胞。采用实时荧光定量PCR法[14]检测单个核细胞中miR-326水平。步骤如下：取TRIzol试剂加至装有单个核细胞的试管中提取总RNA；检测总RNA纯度(A260/A280在1.8～2.1)后用Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒将RNA反转录成cDNA；用PCR仪扩增cDNA，扩增条件为95 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，40个循环。内参为U6。miR-326序列F：5′-CCUCUGGGCCCUUCCUCCAG-3′，R：5′-GCTGTCAACGATACGCTACCTA-3′；U6序列F：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，R：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。用2-DDct计算miR-326水平。
1.3 随访及预后评价 采用电话随访或门诊方式了解ACS患者预后情况。于ACS患者出院后随访，每3个月随访1次，共随访3年。本研究将随访过程中发生MACE定义为预后不良。MACE包括UA、再发心肌梗死、支架内再狭窄、靶血管血运重建及全因性死亡等。
1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件分析数据。计量资料比较采用独立样本t检验和重复测量的方差分析。计数资料比较采用χ2检验。采用受试者工作特征曲线(receiver operating characteristic curve，ROC)分析miR-326评价ACS患者预后的效能。采用Kaplan-Meier绘制高miR-326组和低miR-326组生存曲线，并用Log-Rank法比较差异。采用Cox回归分析影响ACS患者预后的因素。采用限制性立方样条拟合Cox回归分析miR-326与ACS患者预后的关系。应用R 3.6.3软件绘制限制性立方样条图。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 ACS患者PCI后预后情况 205例ACS患者PCI后共有预后不良66例(32.20%)，其中再发UA15例(7.32%)，再发心肌梗死29例(14.15%)，支架内再狭窄13例(6.34%)，靶血管再次血运重建6例(2.93%)，心源性死亡3例(1.46%)。
2.2 两组miR-326水平比较 根据ACS患者预后情况将其分为预后不良组和预后良好组。两组miR-326水平随时间进展均呈升高趋势，其组间、时点间、组间·时点间交互作用差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。
表1 两组miR-326水平比较
Table 1 Comparison of miR-326 levels between two groups
组别 例数PCI前PCI后3 dPCI后7 d预后不良组 660.15±0.040.18±0.040.22±0.02预后良好组 1390.14±0.040.21±0.060.26±0.03组间 F值=300.288 P值<0.001时点间 F值=26.325 P值<0.001组间·时点间F值=21.259 P值<0.001
2.3 miR-326评价ACS患者预后的效能 PCI后7 d miR-326诊断ACS患者预后的ROC曲线下面积(area under the curve，AUC)为0.886，高于PCI前miR-326和PCI后3 d miR-326诊断ACS患者预后的ROC AUC，差异有统计学意义(Z=6.557、5.803，P<0.001)，见图1，表2。
表2 miR-326评价ACS患者预后的效能
Table 2 Efficacy of miR-326 in evaluating the prognosis of ACS patients
指标AUC约登指数截断点敏感度(%)特异度(%)95%CIPCI前miR-326 0.5570.1140.0898.4812.950.486～0.626PCI后3 d miR-3260.6470.2930.2495.4533.810.577～0.712PCI后7 d miR-3260.8860.7230.2492.4279.860.834～0.926
图1 miR-326评价ACS患者预后的ROC曲线
A.PCI前miR-326诊断ACS患者预后的ROC曲线；B.PCI后3 d miR-326诊断ACS患者预后的ROC曲线；C.PCI后7 d miR-326诊断ACS患者预后的ROC曲线
Figure 1 ROC curve of miR-326 in evaluating the prognosis of ACS patients
2.4 两组一般资料比较 根据PCI后7 d miR-326诊断ACS患者预后的截断点将205例ACS患者分高miR-326组(miR-326>0.24)116例和低miR-326组(miR-326≤0.24)89例。两组在年龄、性别、BMI、高血压史、高脂血症史、糖尿病史、ACS家族史、ACS类型、血管病变支数和病变位置比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。
表3 两组一般资料比较
Table 3 Comparison of baseline data between two groups
组别 例数性别(例数)男性女性年龄(x-±s,岁)BMI(x-±s)高血压史(例数)高脂血症史(例数)糖尿病史(例数)ACS家族史(例数)低miR-326组89642555.60±9.5726.63±3.344639279高miR-326组116803655.84±9.2526.56±2.755161376χ2/t值0.2090.5740.1511.2041.5490.0571.812P值 0.6480.5670.8800.2730.2130.8110.178
表3 (续)
组别 例数ACS类型STEMINSTEMIUA血管病变支数单支多支病变位置左主干前降支回旋支右冠状动脉低miR-326组8921422632579481418高miR-326组11629642343737701722χ2值2.5170.0271.512P值 0.2840.870.679
2.5 两组生存预后比较 高miR-326组平均生存时间为35.52(95%CI：35.06～35.98)个月，高于低miR-326组[23.72(95%CI：21.44～26.00)个月]，差异有统计学意义(Log-Rank χ2=107.902，P<0.001)，见图2。
图2 两组生存曲线
Figure 2 Survival curves of two groups
2.6 影响ACS患者预后的因素分析 将ACS患者预后(预后良好=0，预后不良=1)作为因变量，将ACS患者性别(女性=0，男性=1)、年龄(连续性变量)、BMI(连续性变量)、高血压史(无=0，有=1)、高脂血症史(无=0，有=1)、糖尿病史(无=0，有=1)、ACS家族史(无=0，有=1)、ACS类型(STEMI=1，NSTEMI=2，UA=3)、血管病变支数(单支=0，多支=1)、病变位置(左主干=1，前降支=2，回旋支=3，右冠状动脉=4)和miR-362(连续性变量)(PCI后7 d)作为自变量，分别纳入Cox单因素回归分析，结果显示ACS家族史和miR-362与ACS患者预后有关(P<0.05)。进一步将ACS家族史和miR-362作为自变量纳入Cox多因素回归分析，结果显示miR-362是ACS患者预后的独立保护因素(P<0.05)。见表5～6。
表5 ACS预后的单因素Cox回归分析结果
Table 5 Univariate Cox regression analysis results of prognosis of ACS
变量回归系数标准误Wald χ2值P值HR值95%CI年龄0.0020.0130.0210.8851.0020.976～1.028性别0.0650.2720.0580.8101.0680.628～1.814BMI0.0400.0410.9700.3251.0410.961～1.128高血压史0.2100.2460.7250.3941.2330.763～1.994高脂血症史-0.0950.2470.1470.7010.9100.562～1.472糖尿病史0.1090.2610.1750.6761.1160.670～1.856ACS家族史0.8820.3596.0330.0142.4171.199～4.869ACS类型0.1220.1790.4650.4951.1300.797～1.601血管病变支数-0.0580.2540.0510.8210.9440.576～1.549病变位置0.0230.1380.0270.8681.0230.782～1.340miR-362-3.2580.46748.731<0.0010.0390.016～0.096
表6 ACS预后的多因素Cox回归分析结果
Table 6 Multivariate Cox regression analysis results of prognosis of ACS
变量回归系数标准误Wald χ2值P值HR值95%CIACS家族史0.6130.3602.8990.0891.8470.915～3.727miR-362-3.2370.46748.009<0.0010.0390.016～0.098
2.7 miR-362与ACS患者预后的关系 采用限制性立方样条拟合Cox回归分析miR-362(PCI后7 d)与ACS患者预后的关系。比较不同节点个数对应模型的AIC值，确定节点个数为4时，AIC值最小(566.737)。miR-362与ACS患者预后有关(χ2=40.17，P<0.001)，且为非线性关系(χ2=27.33，P<0.001)。以PCI后7 d miR-326诊断ACS患者预后的截断点为参考点，miR-326<0.24时，与miR-326=0.24比较，预后不良的风险升高；当miR-326>0.24时，与miR-326=0.24比较，预后不良的风险降低，见图3。
图3 miR-362与ACS患者预后的限制性立方样条图
Figure 3 Restricted cubic spline of prognosis in patients with ACS and miR-362
3 讨 论
ADAM17作为miR-326的下游靶点，是多种细胞因子活化裂解的关键酶，参与血管的病理生理过程[15]。ADAM17在冠心病患者动脉粥样硬化斑块表面高表达[16]，且可通过裂解肿瘤坏死因子α、白细胞介素1、白细胞介素6等参与血管慢性炎症反应[11,17]。基于上述研究结果，笔者推测miR-326调控ADAM17参与了动脉粥样硬化发病及血管慢性炎症反应。本研究通过比较ACS患者PCI后外周血单个核细胞中miR-326水平，显示随时间进展外周血单个核细胞中miR-326水平呈上升趋势，且预后不良组PCI后3 d、7 d miR-326水平均低于预后良好组，提示外周血单个核细胞中miR-326水平与ACS患者预后有关，检测其水平或可评价ACS患者预后。
以往关于ACS预后评估的指标多为生化指标，如C反应蛋白、胱抑素C及肌酸激酶同工酶等，上述指标在ACS患者预后评估中均存在一定不足。何东旭等[18]采用ROC分析C反应蛋白评价ACS患者预后的效能，结果显示其评价预后的AUC为0.634，效能有限。此外，C反应蛋白多在炎症相关疾病中高表达，若评价合并炎症的ACS患者预后，准确度难免降低。王革等[19]采用ROC分析了胱抑素C评价ACS患者预后的效能，结果显示其评价预后的AUC为0.748，有一定诊断效能，但敏感度和特异度均不高。肌酸激酶同工酶存在于心肌细胞中，可反映心肌细胞损伤情况，当心肌损伤时其水平升高，于发病12～24 h到达峰值，随后降低，48～72 h恢复至正常水平[20]。但由于肌酸激酶同工酶在体内水平持续时间较短，且其水平与ACS发病时间有关，因此，在ACS预后评估中存在一定不足。本研究采用ROC分析了外周血单个核细胞中miR-326评价ACS患者预后的价值，结果显示PCI后7 d miR-326评价ACS患者预后的AUC、敏感度和特异度分别为0.886、92.42%和79.86%，说明PCI后7 d miR-326评价ACS患者预后的效能较高，但特异度偏低，可辅助评价ACS患者预后。
为阐明外周血单个核细胞中miR-326与ACS患者预后的关系，笔者比较了高miR-326组和低miR-326组平均生存时间，结果显示高miR-326组平均生存时间高于低miR-326组，该结果进一步说明外周血单个核细胞中miR-326与ACS患者预后有关。本研究Cox回归分析结果显示PCI后7 d miR-362是ACS患者预后的独立保护因素。此外，限制性立方样条拟合Cox回归分析的结果显示，当miR-326>0.24时，ACS患者预后不良的风险随其水平增加而降低。笔者认为外周血单个核细胞中miR-326与ACS患者预后有关，可能原因如下：一是高水平miR-326可下调ADAM17表达，进而抑制动脉粥样硬化形成，此外，下调炎症相关细胞因子水平改善血管慢性炎症反应；二是miR-326-5p可增加内皮祖细胞血管生成能力[21]，当急性心肌梗死后，骨髓中内皮祖细胞可进入血液循环[22]，促进心肌梗死区域血管生成，改善心脏功能。
本研究尚存在一定不足：一是作为单中心前瞻性研究，样本量有限，且存在一定选择偏倚；二是未开展基础研究阐明miR-326影响ACS患者预后的机制。本课题组下一步将针对以上不足开展研究，以验证并充实本研究结论。
综上所述，ACS患者PCI后外周血单个核细胞中miR-326水平随时间进展成升高趋势。外周血单个核细胞中miR-326水平与ACS患者预后有关，PCI后7 d外周血单个核细胞中miR-326水平是ACS患者PCI后发生MACE的风险因素，检测其水平可辅助评价预后。
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