铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，PA)为一种机会致病菌，是医院感染和呼吸机相关性肺炎中最常见的细菌[1-2]。近些年由于广谱抗菌药物的滥用，导致获得性耐药、适应性耐药和多重耐药菌株频频出现，使得临床用药的选择受到限制。而重症监护室(intensive care unit，ICU)具有环境相对封闭、患者病情严重和侵入性操作较多等特点，PA感染和耐药的情况更为突出[3]。但研究显示不同地区的ICU病房流行的耐药菌株存在差异，即使相同的菌株在不同的ICU病房之间，其耐药率也存在明显差异[4]。分析本院ICU中PA 的耐药情况和耐药基因型的分布对临床治疗有重要的参考价值。
1 资料与方法
1.1 菌株的来源 本研究的菌株选在2019年1月—2020年1月在邢台医学高等专科学校第二附属医院ICU患者送检的临床标本中分离的PA，经过鉴定纳入本研究来自不同患者的42株菌株，接种至含有磁珠的菌种保存管中，放置-80 ℃冰箱中待用。本研究经过医院伦理委员会批准，患者及家属同意并签署知情同意书。
1.2 药物敏感性实验 选用临床上常用的12种抗菌药，氨基糖苷类(庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星)，氯喹诺酮类(左氧氟沙星和环丙沙星)，碳青霉烯类(美罗培南和亚胺培南)，青霉素类(哌拉西林)，β-内酰胺酶抑制剂复合物(头孢吡肟和头孢他啶)，单环β-内酰胺类(氨曲南)和多肽类(多黏菌素B)。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC 27853、大肠埃希菌ATCC 25922和大肠埃希菌ATCC35218(用于β-内酰胺或β-内酰胺酶抑制剂复合物)。参照2018年美国临床和实验室标准化协会推荐的药敏实验方法进行。采用自动化仪器法和纸片扩散法，纸片扩散法仅作为自动化仪器法的补充。制备琼脂培养基，倾注至平板中，厚度为5～6 mm。取一菌株，均匀涂在琼脂培养基表面，用无菌的镊子将待测抗菌药物药片(不同药物浓度)贴在对应的平板内，呈圆形均匀的分开，每个平板贴4～6个抗菌药片，并轻轻按压以免脱落。 在37 ℃培养箱中放置18 h，记录最小的抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)和抑菌圈直径。
1.3 抗菌药物敏感性判断标准 敏感性药敏结果判断依据2018年美国临床实验室标准化委员会标准执行。
1.4 DNA样本提出 冻存菌株放置室温下自然解冻，挑取一环菌株接种至普通营养琼脂上，放置培养箱中过夜，挑取菌落至无菌肉汤中进行增菌培养。收集培养的细菌于离心管中，4 000 r/min，离心10 min。弃去上清，加入500 μL蒸馏水，轻轻混匀，转移至1.5 mL EP管中，放于100 ℃水浴中10 min，然后12 000 r/min离心10 min，将上清保留至-20 ℃冰箱中用于PCR扩增。
1.5 PCR基因扩增 总反应体系为25 μL，具体扩增体系为2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，细菌 DNA 模板1 μL，上游引物(10 μmol/L) 1 μL，下游引物(10 μmol/L) 1 μL，引物序列见表1。无核酸水ddH2O 9.5 μL。PCR扩增的反应条件为预变性94 ℃ 5 min，35个循环，变性94 ℃ 1 min，退火50～65 ℃ 1 min，延伸 72 ℃ 1 min，最终延伸72 ℃ 10 min，短暂存放于4 ℃冰箱中用于琼脂凝胶电泳。
表1 引物序列
Table 1 Primer sequence
目标基因引物序列(5′→3′)目标产物(bp)Genbank收录号blaPERCGTATG AAAAGGACAATCGCA TCCTCGGTTTTCTGG50NG049960.0blaTEM-1CGCCGCATACACTATTCTCAGAATGAACGCTCACCGGCTCCAGATTTAT445KX688041.1blaCTX-M-1GCGATGTGCAGCACCAGTAAGGTTGAGGCTGGGTGAAGTA603KX944738.1blaGESGTTTTGCAATGTGCTCAACGTGCCATAGCAATAGGCGTAG371CP022000.1blaIMPGGAATAGAGTGGCTTAATTCTCCCAAACCACTACGTTATCT188MF479262.1blaOXA-1ACACAATACATATCAACTTCGCAGTGTGTTTAGAATGGTGATC813KU984333.1aac(3)-IIaCGGAAGGCAATAACGGAGGCGCATCTCCAAGACCATG740NG047246.1aac(6′)-IbGCTCTTGGAAGCGGGGACGGTCGCTCGAATGCCTGGCGTG300CP008865.2ant(2″)-IaTCCAGAACCTTGACCGAACGCAAGACCTCAACCTTTTCC700CP021775.1OprD2GCGCATCTCCAAGACCATGGCCACGCGATTTGACGGAG193CP008858.2Int-IAGTCAGCGGCTTAGATAGGTGTGGCGGGCTTCGT457KY171972.1
1.6 琼脂糖凝胶电泳 称取0.2 g琼脂糖干粉，倒入含有18 mL电泳缓冲液的三角烧瓶中，放置微波炉中，加热成透明的液体，冷却至65 ℃时，加入0.2 μL的核酸染液，倾注至凝胶制作槽中，插入制胶梳，待琼脂糖凝胶凝固，加入电泳缓冲液。拔出梳子，加入样本，电泳1～3 h。将凝胶取出，放在含有溴化乙锭的液体中染色30 min，在紫外灯下照相记录电泳图谱。
1.7 统计学方法 应用SPSS 21.1统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验(Fisher确切概率法)。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 PA的检出情况 送检样本共分离出PA菌株65株，成功鉴定出46株PA，排除外周血中和脓液中PA菌株，最终纳入本研究的自下呼吸道的痰液标本中分离出的42株PA，见表2。
2.2 PA对临床上常用药物的耐药结果 PA对临床上常用药物的耐药结果如表2所示，除阿米卡星、妥布霉素、亚胺培南和多黏菌素B外，其余药物的耐药率均在30.0%以上，另外环丙沙星、美罗培南和氨曲南的耐药率达40.0%以上，对多黏菌素B的耐药率为0，敏感率为100%。氨基糖苷类、氯喹诺酮类、碳青霉烯类和头孢菌素组内药物耐药情况比较差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。
表2 PA检测的标本类型
Table 2 Types of specimens of PA tested
标本菌株数构成比(%)痰液 4291.4外周血24.3脓液 24.3合计 46100.0
表3 PA对临床上常用药物的耐药情况
Table 3 The resistance of PA to commonly used drugs in clinical practice (n=42，例数，%)
抗菌药物分类耐药中间敏感χ2值P值氨基糖苷类 庆大霉素13(31.0)2(4.8)27(64.3) 阿米卡星8(19.0)3(7.1)31(73.8)1.8600.761 妥布霉素12(28.6)2(4.8)28(66.7)氯喹诺酮类 左氧氟沙星 环丙沙星16(38.1)17(40.5)3(7.2)4(9.5)23(54.8)21(50.0)0.2640.876碳青霉烯类 美罗培南 亚胺培南17(40.5)11(26.2)3(7.1)8(19.1)22(52.4)23(54.8)3.5810.167青霉素类 哌拉西林15(35.7)6(14.3)21(50.0)β-内酰胺酶抑制剂复合物 他唑巴坦14(33.3)5(11.9)23(54.8)头孢菌素 头孢吡肟 头孢他啶14(33.3)16(38.1)2(4.8)2(4.8)26(61.9)24(57.1)0.2130.899单环β-内酰胺类 氨曲南多肽类 多黏菌素B18(42.9)0(0.0)5(11.9)0(0.0)19(45.2)42(100.0)31.672<0.001
2.3 PA的耐药基因和Ⅰ类整合子检测 PA耐药基因检测结果显示，超广谱 β-内酰胺酶相关耐药基因blaPER 基因和blaTEM-1基因未检测到，blaCTX-M-1基因阳性的有3例，携带率为7.1%。碳青霉烯类相关耐药基因中未检测到blaGES 基因，blaIMP基因阳性者8例，携带率为19.0%，blaOXA-1基因阳性者7例，携带率为16.7%。氨基糖苷类相关耐药基因中未检测到aac(3)-Ⅱa基因，aac(6′)-Ⅰb基因阳性患者10例，携带率为23.8%，ant(2″)-Ⅰa基因性患者8例，携带率为19.0%。外排泵基因OprD2缺失患者8例，缺失率为19.0%。Int-Ⅰ携带者10例，携带率为23.8%。
3 讨 论
近些年随着临床抗菌药物的广泛使用和重症患者的有创医疗手段的应用，使得细菌感染类型和耐药性有所改变，院内感染率增加，耐药菌大多为条件致病菌[5]。PA是临床上常见的一种条件致病菌，在2015年发布的临床数据中显示，PA位于不发酵糖革兰阴性菌分离率的前三位[6]。ICU大多为复杂大手术后患者、呼吸衰竭患者、心功能不全的患者等，部分需要呼吸辅助或有创的辅助治疗，增加了PA的感染率。在抗菌药物使用的过程中，PA可激活耐药基因或突变产生耐药基因使其快速适应抗菌环境，表现出不同的耐药机制[7-8]。因此了解本院ICU病房PA耐药现状和主要的耐药基因型对临床指导抗菌药物使用和降低耐药发生率有重要的临床价值。本研究共纳入2019年度ICU病房痰液标本中分离出的PA菌株42株，分离PA的标本主要来源于下呼吸道，与解泽强等[9]研究结果相一致。本研究中分离的PA菌株对抗菌药物的敏感性测试显示，对氨曲南(42.9%)、环丙沙星(40.5%)、美罗培南(40.5%)耐药率较高，均在40.0%以上。本研究中PA对头孢他啶的耐药率为38.1%，明显高于Pang等[7]研究结果显示的头孢他啶的耐药率在7.80%，另外PA对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星的耐药率在本研究中虽处于较低水平，但与胡付品等[6]研究的相比仍较高，因此头孢他啶、庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星的临床使用应严格按照指南进行。PA对氨曲南、环丙沙星、美罗培南对的耐药率较高，在经验性治疗中应引起注意。阿米卡星和多黏菌素B对PA具有较好的抗菌活性，尤其是多黏菌素 B，就本研究结果而言，阿米卡星可作为重度PA感染的首选药物，而多黏菌素B则作为治疗PA的最后一道防线。
本研究对耐药基因型进行分析，超广谱β-内酰胺相关耐药基因中，并未检测blaPER、blaTEM-1基因，而blaCTX-M-1基因阳性率为7.1%，不同的PA可能产生的超广谱β-内酰胺相关耐药基因不同，而同一菌株也可能携带不同的耐药基因型。张雪青等[10]研究显示，浙江地区某院内分离菌株产生的超广谱β-内酰胺相关耐药基因型主要为blaTEM 型。侯天文等[11]在河北地区及向波等[12]在广州地区的研究显示PA菌株中产生超广谱β-内酰胺相关耐药基因型主要为blaPER型，本研究结果与以上研究结果均不一致，可能与耐药基因型的产生有明显的地域特点。碳青霉烯酶耐药基因检测中，42例菌株中共检测到15例碳青霉烯酶耐药基因阳性，blaIMP基因阳性率为19.0%(8例)、blaOXA-1基因阳性率为16.7%(7例)。在氨基糖苷类相关耐药基因型检测中aac(6′)-Ⅰb、ant(2″)-Ⅰa和aac(3)-Ⅱa基因的携带率依次为23.8%、19.0%和2.4%，aac(6′)-Ⅰb基因型的检出率最高。OprD2蛋白是抗菌药物亚胺培南进入PA体内的特异性通道，可与亚胺培南特异性结合，与其他β-内酰胺类的抗菌药物不存在交叉耐药性，有较强的配体特异性[13-14]。本研究中有11例PA对亚胺培南耐药，OprD2蛋白缺失的为8例，另外还有3例对亚胺培南耐药的PA菌株未检测到OprD2蛋白缺失，也可能是由其他的耐药机制。多丽波等[15]研究显示，广西地区的PA外膜蛋白基因的缺失率79.30%，而本研究中OprD2蛋白缺失率仅为19.0%，有明显的差异，可能与收集样本差异、临床经验用药的习惯不同或地区性差异有关。整合子是可在同种或一种细菌之间进行传递的可移动遗传元件，其本身携带多种耐药基因还可通过获取的方式获得耐药基因[16]。blaIMP与blaOXA-1、ant(2″)-Ⅰa、aac(6′)-Ⅰb 均为Ⅰ类整合子中携带的耐药基因盒，在本研究中的检出率为23.8%(10例)，与刘珺[17]的研究结果28.57%相近，提示整合子是PA耐药性传播的一个主要原因之一，因此在临床上需要及时的监测，以免造成菌株间耐药性传播，给PA的临床治疗带来麻烦[18]。
综上所述，本研究对ICU病房分离的PA菌株进行检测，通过分析PA耐药和耐药基因型特点，以期为临床治疗提供帮助；同时应提高对PA耐药性的重视，加强临床监测、控制院内感染降低PA的感染率和耐药率。
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