乙型肝炎病毒( hepatitis B virus，HBV)感染呈世界性流行，全球慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)患者达2.57亿[1]，我国现有HBV感染例数保守估计约有9 300万，其中CHB确诊例数约为2 000万[2]。核苷(酸)类似物是目前使用最为广泛的抗HBV药物[3]，随抗HBV治疗时间延长，HBV易在P基因区产生耐药突变，影响抗病毒治疗效果，引起病情持续进展，增加肝硬化、肝癌、肝功能衰竭及其他并发症发生率[4]，因此在抗HBV治疗中进行病毒耐药监测对CHB的治疗与预后具有重要意义。基因测序是公认的基因突变检测金标准，通过对HBV耐药易突变区域的完整序列进行检测，是判断病毒核酸碱基是否突变的最直接和最可靠的方法[5]。本研究通过对石家庄地区经各种核苷(酸)类似物治疗的1 157例CHB患者HBV P基因区进行基因测序和分析，探讨石家庄地区CHB患者基因型和核苷(酸)类耐药突变情况及其临床意义,为临床工作者在CHB的诊断及治疗提供科学依据。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2014年10月—2019年3月在石家庄市第五医院就诊的CHB患者1 157例，诊断标准采用中华医学会肝病学分会与中华医学会感染病学分会联合制定的《慢性乙型肝炎防治指南(2010年版)》[6]。患者均已服用核苷类似物进行抗病毒治疗,并由于出现病毒反弹而进行乙型肝炎耐药基因测序检测。
本研究经医院医学伦理委员会批准通过，所有患者均知情同意并签署知情同意书。
1.2 方法
1.2.1 标本采集 所有患者均无菌采集外周静脉抗凝血3 mL，3 000 r/min离心5 min，分离血浆用于检测。
1.2.2 采用基因测序技术进行检测 取处理好的血浆标本45 μL采用中山大学达安基因股份有限公司提供的试剂盒在美国ABI公司的7500型荧光定量 PCR仪进行扩增，取PCR扩增产物5 μL，采用ABI310型遗传分析仪进行HBV基因型及耐药突变核酸测序检测，试剂盒由北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司提供，结果分析应用BLAST和DNAstar等软件将测序结果与Gen Bank的标准序列比对，确定患者感染病毒的基因型，并分析P区173、180、204、207、213、181、214、215、236、237、238、184、202及250共14个位点的基因序列，通过提示得出耐药检测图，得出HBV基因耐药测序结果(图1)。
图1 CHB测序检测报告单14个位点报告图
Figure 1 Hepatitis B sequencing report sheet of 14 sites
1.3 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 CHB患者HBV基因分型 检测结果显示，石家庄地区感染的HBV有B型和C型 2类，C型1 108例(95.765%)，B型49例(4.235%)，以C型为主。
2.2 CHB患者不同性别和不同年龄HBV基因分型的分布特征 石家庄地区CHB患者中HBV基因分型B型和C型分布比例差异无统计学意义(P>0.05)；不同年龄间HBV基因分型B型和C型分布比例差异有统计学意义(P<0.05)，41～60岁患者HBV基因分型C型占比最高。见表1。
表1 CHB患者HBV基因分型在不同性别及
不同年龄间的分布特征
Table 1 Distribution characteristics of HBV genotypes
in CHB patients with different genders and different ages (例数，%)
参数例数HBV基因分型B型C型χ2值P值性别 男性 女性86329439(4.519)10(3.401)824(95.481)284(96.599)0.6760.411年龄 ≤20岁 21～40岁 41～60岁 ≥60岁164375711331(6.250)29(6.636)13(2.276)6(4.511)15(93.750)408(93.364)558(97.723)127(95.489)11.7970.008
2.3 CHB患者HBV基因突变位点分布特征 1 157例患者中未发生基因突变172例，单基因位点突变393例，2个基因位点突变361例，3个基因位点突变174例，4个基因位点突变42例，5个基因位点突变10例，6个基因位点突变3例，7个基因位点突变1例，9个基因位点突变1例；基因型分布特点随突变位点数的增多HBV基因分型B型和C型比例差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
表2 石家庄地区HBV基因突变位点分布特征
Table 2 Distribution characteristics of HBV mutation
sites in Shijiazhuang area (例数，%)
多重位点突变例数HBV基因分型B型C型01727(4.069)165(95.930)139325(6.361)368(93.639)236114(3.878)347(96.122)31743(1.724)171(98.276) 4420(0.000)42(100.000)510 0(0.000)10(100.000)630(0.000) 3(100.000)710(0.000) 1(100.000)910(0.000) 1(100.000) χ2值9.731 P值0.284
2.4 CHB患者HBV基因突变POL/RT区耐药突变模式 发生突变的985例患者共检出1 889个突变位点，检测的14个基因位点中，M204I/V/S、L180M、A181V/T/S突变率为14个基因位点发生突变的前3位，不同基因位点中HBV基因分型B型和C型比例差异无统计学意义(P>0.05)；从比例分布上可见V173L、Y214A、Q215S及T184A/G/I/S四个基因位点发生突变的患者基因型均为C型，B型患者中V207I/L/G、M250V/L及P237H这3个基因位点发生突变的占比为前3位，分别为8.989%、6.250%及5.714%。见表3。
表3 石家庄地区HBV基因突变Pol/RT区耐药突变模式
Table 3 Drug resistance mutation pattern in the POL /RT
region of HBV gene mutation in Shijiazhuang area (位点数，%)
多重位点突变位点数HBV基因分型B型C型V173L680(0.000)68(100.000)L180M4149(2.174)405(97.826)M204I/V/S65827(4.103)631(95.897)V207I/L/G898(8.989)81(91.011) S213T572(3.509)55(96.491)A181V/T/S 2387(2.941)231(97.059)Y214A470(0.000) 47(100.000)Q215S140(0.000) 14(100.000)N236T861(1.163)85(98.837)P237H352(5.714)33(94.286)N/H238T/D562(3.571)54(96.429)T184A/G/I/S460(0.000) 46(100.000)S202G/I492(4.082)47(95.918)M250V/L322(6.250)30(93.750) χ2值21.035 P值0.072
2.5 石家庄地区CHB患者HBV基因耐药模式 发生突变的985例患者对拉米夫定(lamivudine，LAM)，替比夫定(telbivudine，LDT)，阿德福韦酯(adefovir，ADV)及恩替卡韦(entecavir，ETV)四种核苷(酸)类似物耐药模式共检出11种，其中对单一药物发生耐药有3种模式，对2种药物发生耐药的有4种模式，对3种药物发生耐药有3种模式，还有一种是对4种药物均发生耐药。不同耐药模式患者HBV基因分型B型和C型比例差异无统计学意义(P>0.05)，B型患者中占比为前3位分别为对LAM及LDT耐药、对LAM耐药、对ADV及ETV耐药。在C型患者中，对LAM及ADV耐药、对LAM及ETV耐药、对LAM、LDT及ADV耐药、对LAM、ADV及ETV耐药这4种耐药模式占比均为100%。见表4。
表4 石家庄地区HBV基因耐药情况
Table 4 HBV gene resistance in Shijiazhuang area (例数，%)
耐药阳性药物 例数HBV基因分型B型C型拉米夫定(LAM)486(12.500)42(87.500)阿德福韦(ADV)2136(2.817)207(97.183)恩替卡韦(ETV)131(7.692)12(92.308) LAM+LDT71(14.286) 6(85.714)LAM+ADV280(0.000) 28(100.000)LAM+ETV30(0.000) 3(100.000)ADV+ETV101(10.000) 9(90.000)LAM+LDT+ETV54023(4.259) 517(95.741)LAM+LDT+ADV10(0.000) 1(100.000)LAM+ADV+ETV40(0.000) 4(100.000)LAM+LDT+ADV+ETV1184(3.390)114(96.610) χ2值13.796 P值0.183
3 讨 论
核苷(酸)类似物为CHB患者的抗病毒治疗中的常规治疗药物之一，具有用药方便、迅速抑制HBV复制、不良反应少等优点，但是由于广泛、长期、不规范使用以及治疗依从性差等原因，近年发现各种耐药变异株出现，使治疗达不到理想的效果，以至于延误病情[7]。目前多项研究发现HBV基因型分布存在地域性差异,我国汉族南方以B型为主,北方以C型为主,A型和D型在西藏等部分地区存在。本研究结果显示，1 157例患者中C型1 108例(95.765%),B型49例(4.235%),可见石家庄地区CHB患者感染的HBV以C型为主,少量为B型,与以前的文献报道结果[8-9]一致。 本研究结果显示，石家庄地区CHB患者中HBV基因分型B型和C型分布比例差异无统计学意义(P>0.05)；不同年龄间HBV基因分型B型和C型分布比例差异有统计学意义(P<0.05)，41～60岁患者HBV基因分型C型占比最高。与目前研究认为随年龄增加B型占比下降，C型占比增高的结论相一致[10]。由于石家庄地区CHB患者以C型为主，B型占比很低，B型主要流行在南方，石家庄地区B型患者年龄偏低，可能这些患者去南方打工、求学等经历而造成B型HBV感染，本地固定的居民则以C型感染为主，可以考虑以后对这些患者的感染途径进一步收集资料分析，以便指导石家庄地区HBV的预防。
本研究1 157例患者中发生基因位点突变985例，其中单基因位点突变393例，占比最高，双基因位点突变361例，占比次之，占突变患者的大多数，另外还有3个基因位点、4个基因位点、5个基因位点、6个基因位点、7个基因位点及9个基因位点的突变，随基因突变位点增高，患者例数占比逐渐降低，但基因分型分布特点随突变位点数的不同，HBV基因分型B型和C型比例差异无统计学意义(P>0.05)，但是从比例分布上可见B型多为单位点、双位点及3位点突变，而4个位点以上的突变均为C型，所以在石家庄地区随基因突变位点增多而C型患者数占比不断增高，B型患者数随基因突变位点增多而占比不断降低。与王麟等[11]的研究结果一致。
对发生突变的CHB患者985例所感染的HBV的基因的POL/RT区的14个基因位点进行检测，分析其耐药突变模式，共检出1 889个基因位点发生突变，14个基因位点中，M204I/V/S、L180M、A181V/T/S突变率为前3位，不同基因位点中HBV基因分型B型和C型比例差异无统计学意义(P>0.05)，从分布上可见V173L、Y214A、Q215S及T184A/G/I/S 4个基因位点的突变只在C型患者中可见，B型患者未发生这四个位点的突变，B型患者中V207I/L/G、M250V/L及P237H这3个位点占比为前3位，可见C型和B型患者出现的基因突变位点还是有一定的差异。
目前对CHB患者进行抗病毒治疗常用的核苷(酸)类似物如LAM、ADV、ETV及LDT，无论单一用药还是联合用药，均取得一定的效果[12-14]。本研究中发生基因突变的CHB患者均是使用这4种核苷(酸)类似物经过一定时间的抗病毒治疗后，病毒核酸发生不同程度的反弹，经过经基因测序检测后，利用软件对测序结果中的突变位点分析患者对这4种核苷(酸)类似物的耐药情况。本研究结果显示,发生突变的985例患者中对LAM、ADV、ETV及LDT四种核苷(酸)类似物发生耐药共检出11种模式，其中有3种形式是对单一药物发生耐药，分别对LAM、ADV及ETV发生耐药；对2种药物发生耐药的有4种模式，对3种药物发生耐药有3种模式，还有一种模式对4种药物均发生耐药。对LAM、LDT及ETV 均发生耐药540例，其次是对ADV耐药213例，位于第3位的是对4种药物均耐药118例，其余8种情况各自占比均未超过5%。这和基因位点的突变结合分析一致，在14个基因位点检测分析中，M204I/V/S占比为34.833%，在突变的基因位点中占比最高，而此基因位点为LAM、ETV及LDT的主要耐药基因位点[6]，由此可见此基因位点的突变率最高，由此导致石家庄市CHB患者对LAM、ETV及LDT均发生耐药率的原因之一；A181V/T/S占比为12.599%，为第三高基因突变的位点，此基因为发生ADV耐药的主要基因；由此可见对这4种核苷(酸)类似物耐药情况和基因位点一致。LAM价格相对便宜，抑制HBV见效明显，容易被广大CHB患者接受，所以在石家庄地区成为CHB患者抗病毒早期选用的主要药物，也就导致LAM耐药发生的患者最多[15]。目前发生LAM耐药的患者多数采用LAM联合ADV进行挽救，所以近年石家庄地区ADV耐药的患者不断增高。每一种耐药模式的患者中HBV基因分型B型和C型比例差异无统计学意义(P>0.05)，B型患者中占比较高的前三位分别为对LAM及LDT耐药、对LAM耐药、对ADV及ETV耐药。在C型患者中，对LAM及ADV耐药、对LAM及ETV耐药、对LAM、LDT及ADV耐药、对LAM、ADV及ETV耐药这4种耐药情况均占比100%。总之，石家庄地区CHB患者主要发生多重耐药，多数对2种以上核苷酸类似物耐药，所以进行基因测序很关键，当发生基因突变时，应及时进行基因测序确认耐药情况，从而调整治疗方案抑制病毒复制。
综上所述，通过对1 157例CHB患者的基因型和耐药基因进行分析，石家庄地区CHB患者感染的基因型主要是C型，少量是B型，B型多见于40岁以下患者，C型多见于40岁以上患者。在对14个基因位点进行分析，可见C型随基因突变位点增多而占比不断增高，B型随基因突变位点增多而占比不断降低，其中M204I/V/S、L180M、A181V/T/S为发生基因突变率的前三位，由此对4种核苷(酸)类似物LAM、LDT、ADV及ETV发生的耐药情况则以多重耐药多见，所以在石家庄地区CHB患者发生耐药情况时，应进行基因分型及基因测序的检测，从而有利于指导临床抗病毒治疗。
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