食管癌在我国的发病率和病死率居于世界之首，已成为肿瘤防治的重点。统计学数据表明，进展期食管癌的总生存率较低，但早期食管癌的5年生存率高达90%[1]，因此，提高早期食管癌及癌前病变的检出率并给予适当的治疗，是改善食管癌预后的关键。随着内镜设备的快速发展，窄带成像放大内镜(narrow-banding imaging system with magnifying endoscopy，NBI-ME)逐渐用于食管表型病变的诊治，其中，以NBI-ME下食管上皮乳头内毛细血管袢(intrapapillary capillary loop，IPCL)分型应用最广。IPCL分型是日本食道学会制定的食管癌分型标准，随着排序的向后，肿瘤浸润程度和食管癌恶变的可能均加深，与食管癌的病变程度和预后相关[2]。由于食管癌是基因调控下多种信号通路协同作用导致的细胞病变，故而相应的肿瘤蛋白在食管癌组织中特异性表达，与肿瘤的浸润转移密切相关。细胞周期素D1(Cyclin D1)是鼻咽癌相关基因6调控EGFR/K-ras/JNK/c-Jun/ CyclinD1通路的蛋白产物，能够促进细胞由G1期转化为S期间，促进细胞增殖[3]；血小板衍生生长因子受体(platelet derived growth factor，PDGFR)是癌相关成纤维细胞分泌的特异性蛋白，能够促进肿瘤细胞增殖，提高侵袭力[4]，二者均为食管癌早期诊断、预后评估的潜在分子标志物。本研究分析IPCL分型联合Cyclin D1、PDGFR在食管癌早期诊断和预后评估的价值，报告如下。
1 资 料 与 方 法
1.1 一般资料 选取我院消化疾病中心2012年12月—2013年12月收治的经NBI-ME检查的食管浅表型病变患者118例(病变118处)，男性76例，女性42例，年龄45～88岁，平均(67±8)岁。病变位于食管上段17例，中段77例，下段24例。按照2009年日本食道学会定值的食管癌分级标准进行病理分析，结果显示食管炎14例，低级别上皮内瘤变(1ow grade intraepithelial neoplasia, LGIN)6例，早期食管癌83例，SM1期食管癌5例，SM2期及深食管癌10例。
本研究获得医院伦理委员会批准。
1.2 纳入标准与排除标准 纳入标准：①有完整的病理临床资料；②病变长度1～5 cm；③无食管癌病史，入组前未经任何放化疗或药物治疗；④无其他肿瘤病史；⑤未发现远处转移；⑥自愿参与本研究，并签署知情同意书。排除标准：①合并严重心、脑、肺、肾部疾病；②合并食管内镜检查禁忌证；③年龄≥90岁；④合并精神性疾病；⑤合并多处病变者。
1.3 方法
1.3.1 IPCL分型 所有研究对象均经NBI-ME检查，设备为NBI、Olympus H260Z/Olympus CV-260SL放大内镜，依据井上晴洋分型方法[5]进行IPCL分型，分为Ⅰ型(形态正常，碘染色呈阴性)、Ⅱ型(碘染色轻度着色，出现延长或扩张表现)、Ⅲ型(血管形态有或者无轻微改变)、Ⅳ型(血管出现扩张、蛇行、管径粗细不均或形态不规则等2种或3种变化)、V1型(血管出现扩张、蛇行、管径粗细不均或形态不规则等4种变化)、V2型(在V1型基础上出现血管延长)、V3A型(水平血管结构高度破坏，扩张的IPCL沿表层水平方向走行)、V3B型(在V3A的基础上血管延长向深部扩展，异常血管间呈树枝状连接)、VN型(明显新增肿瘤血管，管径增粗)。
1.3.2 食管癌组织Cyclin D1、PDGFR检测 取食管癌组织，常规石蜡切片，脱蜡水化处理后，经免疫组化染色，检测食管癌组织Cyclin D1、PDGFR表达情况。试剂盒购自于北京中杉金桥公司，操作参照试剂盒说明书进行。
结果判断：出现棕黄色颗粒为Cyclin D1表达阳性，出现红色阳性颗粒为PDGFR阳性染色。由2位病理学家使用同一光学显微镜读片，各自选择3个高倍镜视野，每个视野计数200个细胞，计算阳性肿瘤细胞所占的百分比，依据百分比记为0分(<5%)、1分(5%～25%)、2分(26%～50%)、3分(51%～75%)和4分(>75%)。染色强度：不染色记为0分，淡黄色记为1分，棕黄色记为2分，棕褐色记为3分。将二者乘积后判断染色结果：0～1分为阴性(-)，2～4分为弱阳性(+)，5～7分为阳性(++)，≥8分为强阳性(+++)。
1.3.3 治疗方法 所有患者均经内镜下黏膜切除术或内镜黏膜下剥离术治疗。
1.3.4 随访及预后判断 所有患者术后均进行随访，随访时间5年以上，记录患者病死情况。
1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件分析数据。计数资料比较采用χ2检验比较，等级资料比较采用秩和检验，早期食管癌预后影响因素采用Cox回归分析。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 IPCL分型与病理结果分析 食管癌浅表型病变IPLC分型Ⅲ型、Ⅳ型以食管炎、LGIN为主，V1型、V2型、V3A型以早期食管癌为主，V3B型、VN型以SM1、SM2及深食管癌为主。见表1，图1。
表1 食管浅表病变IPCL分析与病理诊断结果分析
Table 1 IPCL analysis and pathological diagnosis of superficial esophageal lesions (例数)
IPCL分型食管炎LGIN早期食管癌SM1SM2及以深食管癌合计Ⅲ型8200010Ⅳ型6260014V1型10321034V2型00221023V3A型00173121V3B型0042410VN型001135 合计14683510118
图1 食管浅表型病变内镜A.IPLC分型Ⅲ型,病理为LGIN;B.IPLC分型V1型,病理为早期食管癌;C.IPLC分型V2型,病理为早期食管癌;D.IPLC分型V3A型,病理为早期食管癌;E.IPLC分型V3B型,病理为SM1食管癌;F.IPLC分型VN型,病理为SM2及以深食管癌Figure 1 Endoscopy of superficial esophageal lesions
2.2 IPLC分型诊断食管癌的效果 V1型、V2型、V3A型诊断早期食管癌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为85.5%、80.0%、91.0%、83.9%；以V3B型、VN型诊断SM2及以深食管癌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为70.0%、92.6%、46.7%、90.7%；以Ⅲ型、Ⅳ型、V3B型、VN型诊断早期食管癌的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为13.3%、20.0%、29.2%、8.9%，见表2。
表2 IPLC分型诊断食管癌的效果
Table 2 Effect of IPLC typing in the diagnosis of esophageal cancer (%)
IPCL分型敏感度特异度阳性预测值阴性预测值V1型V2型85.580.091.083.9V3A型Ⅲ型Ⅳ型13.320.029.28.9V3B型VN型70.092.646.790.7
2.3 Cyclin D1、PDGFR在食管癌组织中表达情况分析 食管炎、LGIN、早期食管癌、SM1、SM2及以深食管癌组织中Cyclin D1、PDGFR表达程度差异有统计学意义(P<0.05)，早期食管癌、SM1、SM2及以深食管癌组表达程度显著高于食管炎、LGIN组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表3。
表3 Cyclin D1、PDGFR在食管癌组织中表达情况分析
Table 3 Analysis of Cyclin D1 and PDGFR expression in esophageal cancer tissues (例数)
组别例数Cyclin D1-++++++PDGFRα-++++++食管炎组141400013100LGIN组651006000早期食管癌组83173441∗#063542∗#SM1组50131∗#0131∗#SM2及以深食管癌组100145∗#0136∗# Z值98.624106.458 P值<0.001<0.001
*P值<0.05与食管炎组比较 #P值<0.05与LGIN组比较(秩和检验)
2.4 早期食管癌预后影响因素的Cox回归分析 定义自变量为：PCL分型V3A型=1，V1型、V2型=0；Cyclin D1强阳性表达=1，其他=0；PDGFR强阳性表达=1，其他=0。食管癌预后情况作为因变量。结果显示，早期食管癌IPCL分型、Cyclin D1及PDGFR的表达均为早期食管癌预后的独立危险因素。见表4。
表4 Cox回归分析结果
Table 4 Results of Cox regression analysis
指标回归系数标准误Wald χ2值P值RR值95%CIPCL分型0.8360.24313.039<0.0012.3381.473～3.745Cyclin D10.7930.22512.034<0.0012.0931.402～3.293PDGFR 0.7830.2179.834<0.0012.0341.372～3.271
3 讨 论
食管癌多发于亚洲国家，居于全球死因的第6位。进展期食管癌预后极差，手术切除治愈率在20%以下，手术前后的放疗仅为辅助作用，对于提高生存率无益，因此，食管癌的早发现、早切除是改善预后的重点[6]。目前，消化道肿瘤的早期诊断主要依靠内镜常规内镜、放大内镜、色素内镜等，操作简单，诊断效果较好。然而，肿瘤发病机制复杂，单独依靠内镜直观观察肿瘤组织形态诊断食管癌，预测预后，容易漏诊或误诊[7]。随着肿瘤发病机制研究的深入，特异性分子标志物逐渐用于肿瘤诊断。本研究分析IPCL分型联合肿瘤标志物Cyclin D1、PDGFR在早期食管癌诊断和预测中的效果。
国内外多篇文章研究显示，NBI-ME下观察IPCL形态并进行分型有助于食管癌病灶的诊断[8-9]，但诊断标准不统一。本研究选取国际广泛使用的井上晴洋的方法，分析浅表型病灶118例IPLC分型与病理结果的相关性，结果显示IPLC分型Ⅲ型、Ⅳ型以食管炎、LGIN为主，不需要进行进一步的治疗；V1型、V2型、V3A型以早期食管癌为主，需要进行手术切除，其诊断早期食管癌的敏感度和特异度均在80%以上，诊断效果较好，对于早期食管癌的诊断具有重要价值[10]。而V3B型、VN型以SM1、SM2及以深食管癌为主，需经手术或放化疗治疗，其诊断的敏感度和特异度分别为70.0%、92.6%。尽管IPCL分型能够有效诊断早期食管癌，并评估病灶浸润程度，有助于指导医师治疗方案的选择，但是，肿瘤生长过程中伴随着血管的异型增生，导致IPCL分型的准确量化存在困难，且内镜检查受心跳、呼吸、黏膜蠕动等影响，诊断具有一定的主观性[11]。
肿瘤特异性分子标志物弥补了IPCL分型的不足，能够客观评估肿瘤的恶化程度，对于食管癌的早期诊断和预后预测具有重要意义。Cyclin D1是细胞周期家族的重要成员，是细胞周期的正性调控因子，其高表达可激活CDK4，降低抑癌基因表达产物Rb蛋白对细胞周期的制动作用，促进细胞周期由G1期间向S期变化[12]。CAFs是肿瘤微环境中最主要的细胞类型，PDGFR是由CAFs分泌的细胞因子，具有促进上皮恶性转化、肿瘤的发生、侵袭和转移的作用，是食管癌发生和发展的必要条件[13]。目前，Cyclin D1、PDGFR均已成为食管癌潜在的诊断和治疗靶点[14-15]。本研究结果显示，Cyclin D1、PDGFR在食管炎、LGIN、早期食管癌、SM1、SM2及以深食管癌组织中表达存在差异，随着肿瘤恶性程度的增加，表达程度增强。因此，对于Cyclin D1、PDGFR表达程度较高的早期食管癌患者，浸润和淋巴转移的风险较高，在手术切除后应密切监测复发和转移情况，并依据术后复发情况给予相应的放疗或化疗等措施，以改善患者预后。
IPCL分型、Cyclin D1及PDGFR的表达均与早期食管癌的预后有关，Cox回归分析显示，三者均为早期食管癌预后的独立危险因素，表明三项指标联合应用，有助于全面评估食管癌病灶的危险程度及预后，以便医生为患者选择最佳的治疗方案，改善预后。
由于本研究样本量较少，结果还有待于进一步扩大化的前瞻性试验加以证实。另外，本文尚未对IPCL分型、Cyclin D1及PDGFR三者联合诊断和预测预后的联合方式进行研究，后续研究将进一步进行。
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