不同冰冻条件对肌性组织标本冻存效果的影响

组织切片作为医学研究中最常用的实验方法，保存良好的组织形态是后续实验重要的前提，最常见的是石蜡切片和冰冻切片两种类型。石蜡切片虽然可以使组织表现出良好形态[1]，但脱水、透明等中间环节中的有机试剂会使组织样品中的蛋白质发生不同程度的变性，而冰冻切片可以更好的保持组织细胞抗原的活性而被广泛应用[2]。冰冻切片主要应用于一些组织化学方法和免疫组织化学方法、临床手术的快速病理诊断等。冰冻切片的质量受多种因素的影响，如取材手法、冰冻方法、切片方法等，其中冻存方法[3]或冰冻速度[4]对组织有明显的影响。然而，对于不同肌性组织(如骨骼肌、心肌和平滑肌)标本最适宜的冰冻条件尚无比较性研究证据。常用的组织标本冰冻有三种方式：①将组织直接投放到液氮中(简称液氮浸入法)，使其快速冷冻；②将组织放入锡纸托中，漂浮于液氮上(简称液氮漂浮法)，使其以慢于液氮浸入法的速度冷冻；③将组织直接置于-80 ℃冰箱(简称直接-80 ℃法)，使其以更慢的速度冷冻。本研究通过切片苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色对比这三种方法处理的骨骼肌、平滑肌和心肌组织形态差异，以期能够得出不同肌性组织冰冻方法的最优条件。

1 材料与方法

1.1 实验动物本实验所用动物为鼠龄8～12周的C57BL/6野生小鼠。饲养于温度湿度恒定的独立通气笼盒系统中，标准鼠粮饲养，饮水为纯净水，自由进食水。环境采用12 h明暗循环，7:00～19:00照明，19:00～次日7:00无照明。

本研究所涉及动物实验已经河北医科大学实验动物伦理委员会批准。

1.2 试剂和仪器手术器械(剪刀，镊子，止血钳，纱布)均经121 ℃，高压灭菌30 min，冰冻切片OCT包埋剂 (Leica)，冰冻切片机(LEICA CM 1950)，刀片(LEICA 819)，载玻片，盖玻片(江苏世泰实验器材有限公司)，中性树胶(国药集团化学试剂有限公司)，无水乙醇，二甲苯，HE染液，正置显微镜(LEICA DM 2000 LED)。

锡纸托的制作：用适量锡纸(深圳市都利实业有限公司)做成一定厚度的近似桶状的托，透明胶带粘牢且保证无漏洞，用金属丝穿过锡纸托上方打好的等距三个孔起到平衡和固定作用。

1.3.1 腓肠肌取材用4%水合氯醛麻醉小鼠后，将小鼠置于解剖板上，四肢固定。钝性分离后取下完整腓肠肌放到OCT包埋剂中，保持位置竖直使切片时可以得到其横截面。

1.3.2 心脏取材剪开胸腔，暴露心脏，将右心房剪破，用挂在2 m高处与输液瓶相连的输液针头刺入左心室，灌入约50 mL于4 ℃预冷的生理盐水，以冲洗血液。灌流后取下完整心脏放到OCT包埋剂中，切片时从心尖切起，待有明显心腔的位置留下切片。

1.3.3 胸主动脉取材灌流后剪下相应位置血管，为避免人为用力撕扯血管改变结构，未剥离周围组织，将其放到OCT包埋剂中，切片时留取血管的横截面，即完整的环形结构。

1.4.1 液氮浸入法将5块组织包埋好后镊子夹住，直接接触液氮并缓慢投入液氮中，包埋剂10～20 s后凝固变白即为冻实。随后放入-80 ℃冰箱。

1.4.2 液氮漂浮法将5块包埋好的组织放入锡纸托，提起金属丝放入液氮，锡纸托直接接触液氮，组织非直接接触。包埋剂冻实比液氮浸入法缓慢，待完全凝固变白即为冻实，随后投入液氮中暂存再放入-80 ℃冰箱。

1.4.3 直接-80 ℃法将5块包埋好的组织直立放在-80 ℃冰箱里，冻存过夜。

1.5 切片方法所用仪器为Leica冰冻切片机。将冰冻切片机待机状态调整为工作状态，箱体温度，刀头温度设定为-20 ℃，同时将镊子、刀片、毛笔等放入箱体内预冷。待达到指定温度后，将组织块安装到组织夹持器上，调整好刀片与组织块的距离和角度。先用旧刀片进行组织粗修，厚度为40 μm，看到明显的组织暴露后，换用锋利的新刀片进行切片，切20片，切下的完整无褶皱的组织薄片迅速的贴附在干净载玻片上，并做好标记。

1.6 HE染色将切片复水后置于苏木素染液2 min，水洗2 min，用1%盐酸乙醇分化15 s，水洗2 min，伊红染液3 s，水洗1 min，70%乙醇2～3 s，80%乙醇2～3 s，90%乙醇2～3 s，95%乙醇5 min，100%乙醇5 min，二甲苯透明后中性树胶封片。

1.7 图像采集及研究指标用正置光学显微镜在10倍和40倍镜下观察，每张切片选取5个同等位置的视野并采集图像；以切片组织完整性良好，无空泡和撕裂缝隙作为质量满意标准，进行对比和分析。比较同一种组织标本经三种不同冻存方法处理后，计算符合满意条件的切片数量占总切片数量的百分率。

1.8 统计学方法应用SPSS 19.0统计软件分析数据。计量资料比较采用单因素方差分析和Tukey检验。P<0.05为差异统计学意义。

2 结果

2.1 骨骼肌(腓肠肌)冰冻条件优化液氮浸入法处理的腓肠肌结构较为完整，肌束紧密、规则，筋膜清晰、完整，液氮漂浮法处理的切片肌束出现密集、不规则空泡，筋膜边界模糊，直接-80 ℃法处理的骨骼肌切片形态结构发生了极其明显的变化，正常的肌束形态完全丧失，出现大量的冰晶空泡，效果最差，见图1。液氮浸入法的切片满意度高于液氮漂浮法和直接-80 ℃法，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 心肌冰冻条件优化用液氮浸入法和液氮漂浮法处理的心肌组织标本，大体结构都比较完整，液氮浸入法的组织切片可见到明显的组织裂隙且数量较多，液氮漂浮法处理的标本，结构更为致密，直接-80 ℃法可完全破坏心肌组织的形态，见图2。液氮漂浮法切片满意度高于液氮浸入法和直接-80 ℃法，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

2.3 血管(动脉)冰冻条件优化液氮浸入法和液氮漂浮法保存的血管壁形态均保持完整，内膜和中膜结构清晰，而直接-80 ℃法出现较多冰晶缝隙，管壁各层紊乱，见图3。液氮浸入法和液氮漂浮法比较差异无统计学意义(P>0.05)，三种方法比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表3。

3 讨论

冰冻切片是一种在低温条件下使组织快速冷却到一定硬度，然后在冷冻状态下用切片机进行切片的方法[5]，其作为一种有效且快速的实验方法广泛应用于科学研究和临床诊断中。在临床上，冰冻切片技术已经成为了病理科的一项常规技术，无论术中快速诊断还是常规病理诊断[6-7]，其准确率更与切片质量密切相关。想要得到高质量的切片应对过程中涉及到的各个环节细致对待，不同组织本身的差异性也应区别看待，这要求实验人员在工作中不断积累经验，摸索出最合适的条件和操作手法。

不同组织在不同冰冻速度下所表现的结果存在差异。研究证明，快速超低温的冷冻极易使脑组织因冰冻不均匀而破裂，但若置于液氮中慢慢冷冻1～2 min，可以减少冻裂现象的发生[8]。有研究指出在液氮表面上方的蒸气中的距离不同，导致冷冻速度差异，冰冻效果有差别[9]。本研究中，心肌和骨骼肌均是横纹肌组织，但结果仍然不同，心肌的最优条件是液氮漂浮法而骨骼肌则为液氮浸入法。血管组织相对于心肌和骨骼肌较薄，液氮浸入法和液氮漂浮法均能快速将组织完全冰冻，对其结构上不会有明显的改变。但直接-80 ℃保存几乎对所有的组织都不适用，可能是跨过最大冰晶生成带时间稍长，组织内形成更大的冰晶使其完整性遭到破坏[10-11]。因此，水分含量比较大的组织更应引起注意，在取下组织后尽量避免接触液体试剂或在生理盐水中浸泡，并且采用滤纸吸除水分等方法以防冰晶的大量形成，影响冰冻效果[12]。另外，根据渗透压及微波的原理也可以有效消除组织内水分[13]。

本研究所用的慢速冷冻方法是直接-80 ℃法，此法的缺点是在包埋剂冻实前组织容易发生位置偏移。相比于慢速冷冻，速冻的方法可以快速跨过冰晶形成的温度区间从而降低冰晶对组织结构的损伤，效果更好。目前应用于科学研究中的组织速冻方法很多，常见的有液氮速冻、液氮/异戊烷法速冻、干冰/无水乙醇混合物速冻等[14]。液氮/异戊烷法速冻是将包埋后的组织放入用液氮预冷的异戊烷中速冻。有研究曾尝试将此方法改进，分为分步冻存法和一步冻存法[15]。前者是将肌肉组织先放入冰块预冷的异戊烷中10 s，在放入液氮预冷的异戊烷中10 s，最后放入液氮中10 s，再进行包埋和-80 ℃冰箱保存。后者是将包埋好的组织放入液氮预冷的异戊烷中60 s，暂时存放到液氮中后再-80 ℃冰箱保存。结果是分步冻存法下冰晶形成更少，细胞结构更加完整。所以梯度降温在组织冻存方法中合理利用是非常重要的。干冰/无水乙醇混合物速冻是将无水乙醇置于干冰中提前预冷，将干冰缓慢加入到无水乙醇至形成黏稠状液体，再将包埋后的组织放入干冰/无水乙醇混合物中速冻。液氮速冻时若操作不当容易造成组织发脆，甚至直接断裂的情况发生，液氮漂浮法则可以避免过度冷冻，改善了这种现象。相比较于其他方法，本文中涉及到的液氮浸入法和液氮漂浮法不需要多余的试剂，操作更为简便。

综上所述，不同的冰冻方法都有各自的优缺点，比如关于方法的简化和冰冻时间的具体化等方面可能需要进一步改良。现已提供了一种摸索组织冰冻最优条件的思路和方法，为新手操作提供参考。

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不同冰冻条件对肌性组织标本冻存效果的影响

1 材料与方法

2 结 果

3 讨 论

Effect of different freezing conditions on the freezing preservation of muscle tissue specimens

2 结果

3 讨论