食管癌(esophageal cancer，EC)是一类发生于食管上皮组织的消化道肿瘤，在所有恶性肿瘤中，EC的发病率为2%，它包括食管鳞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma carcinoma，EADC)两种类型，ESCC的发病率高于EADC[1]。由于具有高浸润性和侵袭转移强的特点，ESCC的治疗效果差、引起患者不良预后[2]。因此，深入探究ESCC浸润转移机制有助于为该疾病的治疗提供新策略。促进恶性肿瘤细胞发生侵袭转移能力关键过程是上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的发生[3]。在EMT发生过程中，E盒结合锌指蛋白1(zinc finger E-box-binding protein 1，ZEB1)是关键的调控转录因子，在多种肿瘤中通过诱导EMT来促进肿瘤的浸润及侵袭转移。ZEB1属于E盒结合锌指蛋白家族，通过结合E-box启动子元件促进下游基因转录[3]。ZEB1高表达也常见于在转移性较高的上皮肿瘤细胞中[4]。此外，细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)、丝裂原活化蛋白激酶信号通路及其下游蛋白c-Myc也在EMT的发生过程中起着调控作用，从而促进肿瘤侵袭转移[3]。而在ESCC中，ZEB1的表达加快肿瘤进程并促进淋巴结转移[5]，但ZEB1对ESCC侵袭转移的调控机制还少有研究。本研究通过基因敲除手段，考察ZEB1表达对ESCC侵袭转移能力的影响，并探讨ZEB1对侵袭转移和细胞增殖相关蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 细胞株 ESCC细胞系EC9706购买于ATCC(American Type Culture Collection)。
1.2 试剂及耗材 细胞总RNA提取和实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)实验中，总RNA利用RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent试剂盒，反转录cDNA使用、HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒，RT-qPCR操作利用SYBR Green PCR Master Mix染料，RT-qPCR相关试剂均购买于南京诺唯赞生物科技有限公司。RT-qPCR引物购买于苏州金唯智生物科技有限公司，ZEB1 primers序列为，F:5′-GCCAATAAGCAAACGATTCTG-3′；R:TTTGGCTGGATCACTTTCAAG。shRNA阴性对照质粒及ZEB1 shRNA慢病毒质粒购买于德国默克公司，ZEB1 shRNA序列：5′-CCGGTGT-CTCCCATAAGTATCAATTCTCGAGAATTGA-TACTTATGGGAGACATTTTTG-3′，CCK8检测试剂盒购买于上海翊圣生物科技有限公司。WB抗体包括β-actin、ERK1/2、p-ERK1/2、N-cadherin和E-cadherin，购买于美国Cell Signaling Technology公司。细胞培养试剂包括DMEM无血清培养基、Gibco血清、胰酶，购买于美国GIBCO公司。免疫印迹法(Western blot，WB)所需试剂，RIPA Buffer和PierceTM BCA Protein Assay Kit购买于美国ThermoFisher公司；SDS-PAGE胶成分Tris 6.8，Tris 8.8，29：1聚丙烯酰胺溶液、十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)、TMED、过硫酸铵购买自上海生工生物工程股份有限公司；电泳所需电源、制胶架、电泳槽及转膜槽购买自美国伯乐Bio-rad公司。
1.3 方法
1.3.1 细胞培养 DMEM培养基(dulbecco′s minimum essential medium，DMEM)用超纯水溶解后，按比例加入一定量的碳酸氢钠，0.22 μm无菌滤膜过滤分装。使用时加入Gibco胎牛血清，120 mg/L链霉素和120 U/mL青霉素，配成含10%血清的DMEM培养基。EC9706细胞置于37 ℃含5% CO2的细胞培养孵箱中孵育增殖。待细胞密度达到80%～90%后胰酶消化并传代。
1.3.2 RT-qPCR 细胞提取总RNA：转染shRNA阴性对照组的EC9706细胞和ZEB1 shRNA沉默后的EC9706细胞从细胞培养瓶中消化，收集离心后，用PBS洗涤2次。细胞沉淀中加入RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent 0.5 mL，用枪头反复吹打，直至细胞团块完全消失；加入RNase Free dH2O 200 μL，上下颠倒混匀后，常温静置15 min，4 ℃下12 000 r/min离心15 min；避免接触管底沉淀，吸取400 μL上清转移至新离心管，加入400 μL异丙醇，反复震荡20 s，然后室温静置15 min，4 ℃下12 000 r/min离心15 min；保留管底白色团块，用移液器吸去上清，75%乙醇洗涤RNA沉淀2次，常温干燥。RNA定量：将乙醇挥发后的RNA用RNase Free dH2O溶解，利用分光光度计和Thermo ScientificTM NanoDropTM QC软件对总RNA浓度进行检测，并用RNase Free dH2O将每组RNA浓度调整为1 g/L。逆转录cDNA：按5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，Total RNA 1 μL，RNase Free dH2O配方一次加入，至总体积10 μL。42 ℃孵育2 min后，于4 ℃冷却，再加入PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0 μL，5×PrimeScriptBuffer 2 4.0 μL，RNase Free dH2O和RT Primer Mix 1.0 μL至总体积20 μL，程序37 ℃运行15 min。85 ℃灭活15 s后终止反应。PCR反应体系如下配制：SYBR Green PCR Master Mix 5 μL，PCR Forward Primer 0.25 μL，PCR Reverse Primer 0.25 μL，cDNA溶液0.5 μL，RNase Free dH2O 4 μL。每个浓度至少测量3个复孔。ABI 7500型荧光定量PCR仪，设定PCR反应程序：Stage 1：预变性Reps：1，95 ℃ 30 s；Stage 2：PCR反应 Reps：50，95 ℃ 5 s；60 ℃ 30 s，进行实时定量PCR扩增。最后，对荧光实时定量PCR数据进行分析，获得结果。
1.3.3 慢病毒shRNA转染 慢病毒ZEB1 shRNA转染：利用HIV病毒将自身基因组插入整合到宿主基因组的特性，让目的细胞稳定表达shRNA，实现沉默目的基因的作用。操作流程：在处于对数生长期的293T细胞内加入10 μg质粒和HIV病毒合成所需要的组分(10 μL Lentiviral Mix和60 μL HG TransgeneTM Reagent)；培养24 h后病毒被293T细胞分泌到胞外，此时回收培养基上清(含病毒)，用0.22 μm滤头过滤后，加入到需要被转染EC9706细胞培养基内；感染EC9706细胞48 h后，将培养基中加入嘌呤霉素进行真核细胞药物筛选，存活下来的即稳转成功的细胞。
1.3.4 CCK8(Cell Counting Kit-8)实验 转染shRNA阴性对照组的ESCC细胞系EC9706和沉默了ZEB1表达的EC9706细胞消化后重悬，以100 μL/孔等量均匀地加入96孔板，两组细胞平行6个副孔。待细胞贴壁后，培养到密度为70%～80%后加入10 μL CCK8溶液，在37 ℃含5% CO2的细胞培养孵箱中培养1～4 h后，与450 nm波长下检测吸光度(optical density，OD)。计算后可得相对细胞活力水平。
1.3.5 划痕实验 转染shRNA阴性对照组的ESCC细胞系EC9706及敲除ZEB1的EC9706细胞进行消化后，用1 mL培养体系均匀培养在6孔板中。待细胞贴壁生长并在密度达到80%后，用移液器枪头在孔内细胞上划痕，保证每条划痕线宽度均匀且平行。划线结束后，用灭菌后PBS轻轻洗涤6孔板，将划痕后漂浮的细胞去除，留下清晰可见的划痕线。对6孔板划痕的固定位置进行记录拍照。划痕0 h拍照记录细胞生长状态后，将六孔板放置回37 ℃细胞培养孵箱继续培养；24 h后再次记录细胞生长状态。
1.3.6 Western blot 收集细胞：对数期生长的转染shRNA阴性对照组的EC9706及敲除ZEB1的EC9706细胞进行消化后，将细胞培养皿用PBS清洗2次后，合并细胞悬液和洗液，转移至塑料离心管，2 300 r/min转速下离心3 min，用移液器弃去上清液，细胞团块用1 mL PBS重悬后，转移到于1.5 mL离心管里，2 000 r/min离心5 min，将上清吸净。蛋白提取：尽可能用移液枪将PBS去除干净。将提前配好的蛋白裂解液按与细胞等体积的量加入1.5 mL Tube管，与细胞混合并轻轻打匀，置于冰上，裂解55 min，每隔10 min轻轻弹动EP管底部。裂解完毕后，用离心机以12 000 r/min离心30 min，将蛋白上清小心吸出并加入新的离心管中。BCA法用于测定样品蛋白含量，将蛋白用水调至同一浓度。然后在蛋白中加入1/3蛋白体积的loading buffer混匀。100 ℃水浴变性10 min后，放置于冰上冷却10 min，12 500 r/min离心1 min后准备上样。如果不立即使用，应将蛋白保存在-20 ℃冰箱中。制胶及电泳分离蛋白：制备SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，60 V浓缩胶，140 V分离胶，运行1～1.5 h。全湿转膜：电泳后取下胶，按尺寸剪取滤纸及NC膜，并将它们浸泡在全湿转膜缓冲液中10 min。按海绵→滤纸→NC膜→胶→滤纸→海绵的顺序依次叠放整齐，除了膜不能用试管擀压外，每铺一层都用试管去除气泡。将夹板放入槽中，加入全湿缓冲液，恒流230 mA，转膜时间为2 h；转膜过程中，转膜装置放在冰盒中。丽染：将转膜后的NC膜浸泡在丽春红染液中，慢摇1 min后用dH2O震荡、清洗，根据Marker指示，剪下目标条带，标记，用PBS洗去丽春红。封闭：配制3% BSA封闭液，将条带封闭，37 ℃恒温摇床中孵育1 h。抗体孵育：用PBST将封闭后的条带荡洗一遍，用PBST配制一抗，将条带用一抗封袋，37 ℃恒温摇床孵育1 后4 ℃孵育过夜；一抗孵育结束后，PBST洗3次，10 min清洗一次。用PBST配制二抗，封袋，37 ℃恒温摇床反应1 h。曝光：二抗孵育结束后，用PBST清洗条带，清洗3次，每次10 min。用PBS浸泡条带后，配置ECL显色液，将条带漂洗10 s后采用Amersham Imager 600超灵敏多功能成像仪进行曝光成像。
1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0统计软件分析数据。计量资料比较采用成组设计的t检验、配对t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 ZEB1 shRNA敲除EC9706细胞中ZEB1表达 为了探究ZEB1蛋白表达是否对ESCC细胞系EC9706的增殖和侵袭转移有关，本研究首先构建了ZEB1敲除的EC9706细胞系。采用ZEB1 shRNA对EC9706细胞系进行慢病毒侵染，通过培养和筛选后获得ZEB1敲减后的稳转细胞株。通过RT-qPCR实验检测ZEB1 shRNA转染后EC9706细胞的ZEB1 mRNA转录水平。结果显示，与阴性对照组相比，ZEB1 shRNA显著降低了ZEB1 mRNA的表达水平(P<0.001)。见表1。
表1 ZEB1 shRNA抑制EC9706细胞ZEB1 mRNA表达
Table 1 ZEB1 shRNA inhibited the expression of ZEB1 mRNA in EC9706 cells 
组别 ZEB1 mRNA表达水平阴性对照组 0.943±0.092ZEB1 shRNA组0.325±0.078t值 223.762P值 <0.001
2.2 敲除ZEB1的EC9706细胞活力降低 为探究敲低ZEB1的EC9706细胞的增殖能力，利用CCK8实验考查细胞活力水平。与转染shRNA阴性对照组的细胞相比，敲低ZEB1的EC9706细胞的细胞活力明显降低(P<0.001)，见表2。
表2 ZEB1 shRNA抑制EC9706细胞活力水平
Table 2 The cell viability of EC9706 cells was reduced by ZEB1 shRNA
组别 细胞活力水平阴性对照组 0.912±0.064ZEB1 shRNA组0.742±0.018t值 117.256P值 <0.001
2.3 敲除ZEB1抑制EC9706细胞的侵袭转移能力 利用划痕实验考察ZEB1蛋白表达对ESCC细胞系EC9706细胞的侵袭转移能力的影响。转染shRNA阴性对照组细胞在划痕24 h后增殖迅速，愈合能力强，划痕宽度显著降低。而敲低了ZEB1表达的EC9706细胞，虽然也有一定程度的增殖和愈合，但划痕宽度明显大于对照组(P<0.05)。见表3。
表3 ZEB1 shRNA抑制EC9706细胞侵袭转移
表3 ZEB1 shRNA inhibited metastasis of EC9706 cells
组别 侵袭转移水平0 h24 h阴性对照组 0.913±0.0750.865±0.044 ZEB1 shRNA组0.925±0.0760.613±0.169*t值 1.24324.745P值 0.256<0.001
*P值<0.01与0 h比较(配对t检验)
2.4 敲除ZEB1抑制ERK1/2激活并调节侵袭转移相关蛋白表达水平 针对EMT相关蛋白的表达进行研究，考察了ZEB1敲除后ERK1/2蛋白的表达和E-cadherin、N-cadherin的表达水平。结果显示(图1)，对比转染shRNA阴性对照组细胞，转染了ZEB1 shRNA的细胞，ZEB1蛋白表达水平明显降低；敲减ZEB1后，细胞ERK1/2的激活水平被抑制；与EMT相关蛋白N-cadherin表达水平降低，E-cadherin表达水平增高。
图1 ZEB1 shRNA抑制ERK1/2激活并调节cadherin表达水平
Figure 1 ZEB1 shRNA inhibited activation of ERK1/2 and regulated expression of cadherin protein levels
3 讨 论
食管癌是发生于食管上皮的恶性肿瘤[6]。目前，手术切除和新辅助化疗食管癌的主要治疗方法。应用于早期食管癌的治疗方案主要是手术切除，当肿瘤进展到中晚期，由于转移扩散的发生，手术治疗效果较差，需要配合化疗[7]。化疗和放疗是治疗食管癌的重要方法。而新辅助治疗，是一种联合化疗或放疗手段在食管癌术前的应用，其作用除了手术前降低食管癌肿瘤分期，使手术获得更好疗效以外，也应用于术后治疗，避免肿瘤向远处转移，从而减少局部复发[8]。但由于食管癌的高侵袭转移性，肿瘤转移和局部复发依旧是食管癌治疗的难点[9]。
恶性肿瘤细胞获得侵袭和迁移能力的关键是上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，消除EMT从而抵抗肿瘤侵袭转移是肿瘤治疗的思路之一[10]。在人类恶性肿瘤中，有80%来源于上皮组织。通过EMT，原发性上皮组织肿瘤细胞可以形成间充质细胞，从而具备了迁移能力，进而向血管内侵袭，随着血液循环转移到人体内其他部位[11]。上皮肿瘤细胞最终通过EMT形成肿瘤转移灶，该过程极大地促进了肿瘤进展和恶性程度，增加了临床治疗难度[11]。目前研究表明，调控EMT的主要转录因子包括Twist、Snail和ZEB[12]。ZEB家族是E盒结合锌指蛋白(Zinc finger E-box binding homeobox)，包含ZEB1和ZEB2两种类型[3]。在调控EMT发生中，ZEB1是关键的转录因子[3]。研究发现在多种肿瘤中，ZEB1可通过诱导EMT来促进上皮肿瘤细胞的侵袭转移[13-14]。ZEB1启动EMT的作用机制可能是ZEB1通过其锌指结构与E-cadherin的启动子区域结合、抑制E-cadherin表达来实现的。综上所述，ZEB1在上皮肿瘤EMT发生和侵袭转移过程中发挥着重要功能[13]。而其他和ZEB1相关的蛋白，如ERK、MAPK信号通路及其下游蛋白c-Myc，在EMT的发生中发挥着重要作用[15]。如在肺癌细胞中，EMT受到ERK和ZEB1通路的广泛调节[16]。而本文针对侵袭转移能力较强的ESCC细胞进行了研究，考察了ZEB1对癌细胞侵袭转移的影响及ERK的表达变化，发现敲低ZEB1表达后，能够显著抑制ESCC细胞系ES9706细胞的细胞活力、降低细胞的侵袭转移能力，并在蛋白水平抑制ERK1/2活性，促进E-cadherin表达和抑制N-cadherin表达。本研究结果显示ZEB1在ESCC细胞侵袭转移上发挥的关键作用，故而提示可以靶向ZEB1进行ESCC的治疗。目前直接靶向ZEB1的小分子抑制剂还鲜有研究，但最新的研究进展中，发现组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)抑制剂在针对肺癌的治疗上可以逆转EMT，使间充质细胞恢复为上皮细胞，这是通过HDAC抑制剂处理抗性细胞过程中可以抑制ZEB1功能而实现的[17]。除了直接抑制ZEB1活性外，ZEB1也受到上游因子PI3K、STAT3和SIRT等蛋白调控[14,18]。如PI3K抑制剂BENC-511，可以通过调控β-catenin-ZEB1通路来抑制非小细胞肺癌细胞侵袭转移[18]。所以也可以通过抑制ZEB1蛋白上游调控因子、干扰ZEB1信号环路，或是切断ZEB1下游控制元件来抑制ZEB1相关通路，从而起到抑制肿瘤细胞EMT和侵袭转移的作用。由于ESCC细胞具有的强侵袭转移性和难治性，故而靶向ZEB1从而达到抗ESCC具有一定研究价值和临床意义。而本研究将在后续的研究中，将致力探讨ERK1/2是否介导ZEB1对E-cadherin和N-cadherin的调控作用，通过过表达ERK1/2观察ZEB1敲除下EMT的变化，从而深入研究ZEB1在ESCC侵袭转移进展中发挥的关键作用，并寻找干扰ZEB1活性的小分子化合物及其抗肿瘤机制。
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