人类基因组中约有80%的非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)，在基因表观遗传调控、转录和转录后加工中起着至关重要的作用[1]，参与神经退行性疾病病理生理过程[2-3]。遗忘型轻度认知功能损害(amentia mild cognitive impairment,aMCI)被认为是阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)早期认知障碍阶段[4]。本研究通过微阵列检测分析aMCI血浆中ncRNA差异表达，基于数据库构建了竞争内源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)网络，对网络中差异信使RNA(messenger RNA，mRNA)共表达基因进行了基因本体论(gene ontology,GO)和京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析，深入了解与aMCI相关的ncRNA有利于为AD开发潜在的新型生物标志物和治疗提供新策略[5]。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本研究选取来自中国纵向老龄化队列研究(CLAS，ClinicalTrials.gov标识符：NCT03672448)的受试者5例为aMCI组，同时选取5例正常人为正常对照组(normal control,NC)。两组性别、年龄和教育水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。
纳入标准：①认知能力在数月至数年中逐渐下降；②维持日常生活能力的独立性；③缺乏血管、外伤或其他医学原因导致认知能力下降的记忆障碍证据；④认知下降不足以满足AD的标准；⑤脑18F-Flutemetamol-PET扫描Aβ阳性。排除标准：①混合或血管性痴呆者；②其他疾病所致认知障碍或痴呆者。
所有受试者或其监护人均提供了书面知情同意书，本研究通过上海市精神中心伦理委员会的批准。
1.2 血浆收集及RNA提取 收集受试者5 mL外周静脉血于乙二胺四乙酸二钾抗凝管中，4 ℃、3 000 r/min,分离心15 min后分离上层血浆。按照说明操作步骤采用TRIzol试剂(Invitrogen，美国)进行样品总RNA抽提，使用QIAGEN RNeasy Mini Kit(Qiagen，德国)纯化。RNA的浓度和纯度通过NanoDrop ND-1000(Thermo Fisher，美国)进行质检，质检合格后进行后续的芯片实验。
1.3 生物芯片技术测定基因表达谱及分析 应用miRCURY LNATM microRNA芯片(Exiqon，丹麦)测定血浆中微小RNA(microRNA,miRNA)表达谱，杂交方法按照制造商的说明书进行，杂交完成后使用Wash buffer kit(Exiqon，丹麦)清洗芯片，Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片，GenePix Pro 6.0读取芯片扫描图像，并提取探针的信号值，对全部芯片进行中值标准化。通过Arraystar人类长链非编码RNA(long noncoding RNA,lncRNA)V4.0芯片测定血浆中mRNA和lncRNA的表达水平，根据说明书进行操作，杂交完成后洗涤芯片，固定并使用Agilent DNA微阵列扫描仪扫描，Agilent特征提取软件(版本11.0.1.1)采集芯片探针信号值，使用GeneSpring GX v12.1软件进行芯片数据标准化以便进一步分析。选取符合表达差异倍数(fold change，FC)对数的绝对数|log2FC|≥1和P<0.05两个条件miRNA，即lncRNA和mRNA为差异有统计学意义的基因。
1.4 lncRNA-miRNA-mRNA调控网络构建 使用PicTar 2005(http://pictar.mdc-berlin.de/cgi-bin/PicTar_vertebrat)、miRanda v5(http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5)和TargetScan 5.1(http://www.targetscan.org/)数据库预测非编码RNA之间相互作用，将数据库预测结果进行交叉，得到lncRNA-miRNA，miRNA-mRNA之间的关系以及差异表达miRNA调控的基因。根据不同的表达miRNA靶基因预测结果以及miRNA和lncRNA关联分析数据，使用Cytoscape软件分析并获得了最终的ceRNA调控网络图。
1.5 差异miRNA 靶基因的功能分析 通过DAVID(http://www.david.abcc.ncifcrf.gov/)在线数据库进行GO和KEGG分析并探讨靶基因的功能作用。
1.6 统计学方法 应用SPSS 22.0统计软件分析数据。计量资料比较采用t检验。P<0.05为差异有统计学意义。计算高通量测序相关数据使用R软件进行统计计算，设定差异有统计学意义的lncRNA和mRNA的阈值为|log2FC|≥1和P<0.05。
2 结 果
2.1 miRNA芯片数据概述 Exiqon的miRNA阵列产生miRNA共3 100个，涵盖在miRBase 19.0中注释的所有人类、小鼠和大鼠miRNA，以及与这些物种相关的所有病毒miRNA，去除低质量的miRNA、小鼠和大鼠的miRNA后，检测到成熟miRNA 1 939个，其中aMCI组中有失调miRNA46个，包括上调miRNA13个和下调miRNA33个，见图1A，如hsa-miR-145-3p，hsa-miR-5691，hsa-miR-3156-3p，hsa-miR-622和hsa-miR-4638-3p是下调的miRNA。进行了miRNA表达的聚类分析，生成了一个热图，见图1B。
2.2 lncRNA与mRNA芯片数据概述 lncRNA微阵列芯片产生总共40,173个lncRNA和蛋白质编码mRNA20,730个，每个转录物均由特定的外显子或剪接点探针表示，该探针可唯一地准确识别单个转录物。aMCI组共有严重失调的lncRNA287个，包括上调的lncRNA67个和下调的lncRNA220个，见图1C。通过聚类分析热图可视化lncRNA的表达，见图1D。aMCI组有显著失调mRNA208个，其中上调mRNA48个和下调mRNA160个，见图1E，对mRNA表达进行聚类分析生成一个热图。见图1F。
图1 遗忘型轻度认知功能损害受试者外周血浆miRNA、ln-cRNA、mRNA表达谱A.miRNA表达火山图;B.miRNA表达热图;C.lncRNA表达火山图;D.lncRNA表达热图;E.mRNA表达火山图;F.mR-NA表达热图Figure1 ExpressionprofilesofmiRNAs,lncRNAandmR-NAinperipheralbloodplasmaofaMCIgroup
2.3 lncRNA-miRNA-mRNA调控网络构建 根据ceRNA假设，ceRNA可以在调节网络中竞争相同的MRE。一个lncRNA可以不同的方式调控多种miRNA，而一种miRNA则可以由多种lncRNA调控。使用PicTar、miRanda和TargetScan三个数据库对微阵列芯片数据进行分析后有lncRNA 3个、miRNA 5个、mRNA 7个参与构建了遗忘型轻度认知功能损害ceRNA调控网络，调控关系见图2。如，lncRNA T093863与失调miRNA 70个相关联，显示hsa-miR-145-3p在微阵列结果中下调。LncRNA可以竞争性地结合miRNA结合，从而间接调控miRNA靶基因。
图2 aMCI组中ceRNA网络图
Figure 2 ceRNA networks in aMCI group
2.4 差异miRNA 靶基因的功能分析 对差异表达的mRNA的功能进行GO分析。GO显示差异表达mRNA主要富集在RNA代谢过程(GO：0051252)、基因表达的调控(GO：0010468)，细胞质应激颗粒(GO：0010494)、细胞核(GO：0005634)、蛋白激酶B结合(GO：0043422)和微管正端结合(GO：0051010)等生物学过程，见图3。
图3 差异表达mRNA的靶基因GO分析
Figure 3 GO enrichment analyses of target genes of differentially expressed mRNA
进行KEGG通路分析以确定基因相关信号传导通路，显示8条KEGG通路与上调mRNA相关，差异有统计学意义(P<0.05)，包括单纯疱疹病毒1感染，催产素信号、甘露糖型O聚糖生物合成、叶酸生物合成、EGFR酪氨酸激酶抑制剂的耐药性、大肠癌、甲状腺癌和IL-17信号通路，见图4。
图4 差异表达mRNA的靶基因KEGG分析
Figure 4 KEGG pathway analyses of target genes of differentially expressed mRNA
3 讨 论
AD是常见的神经退行性疾病，其病理机制仍不确定，随着中国社会进入老龄化，该病给医疗护理和社会经济带来的负担日益严峻。研究表明，ncRNA在AD病理生理进程中发挥重要作用[6]，AD病理生理改变在临床症状出现前已存在。aMCI被认为是AD进展的无症状阶段，找到aMCI失调ncRNA可以促进其作为生物标记物的开发和AD治疗的新靶点，对AD预防、诊断及治疗均有非常重要的意义[7]。本研究中，对aMCI受试者和对照组外周血浆中的lncRNA、miRNA和mRNA表达谱进行微阵列分析，获得差异有统计学意义的基因，使用|log2FC|≥1和P<0.05的阈值，显示aMCI组和NC组存在差异有统计学意义的上调lncRNA 67个和下调lncRNA220个，上调miRNA 13个和下调miRNA 33个，上调48个mRNA和下调mRNA 160个。使用PicTar、miRanda和TargetScan三个数据库对其相互作用进行预测，通过可视化的软件 Cytoscape建立ceRNA网络，揭示三者的相互作用关系。既往研究显示，此差异表达的RNA与AD的发病机制有关，如SPSB1与MCI向AD的转化有关，而NPLOC4在神经退行性疾病(帕金森病、精神分裂症和AD)中表现出多效作用[8]。
LncRNA是一种调节各种生物学功能的主要非蛋白编码转录本[9]。越来越多的证据表明，lncRNA可以作为ceRNA干扰miRNA，发挥“海绵”的作用，从而影响其常见的mRNA功能。研究报道癌症研究领域中的ceRNA机制和网络构建[10]，但对于神经退行性疾病的ceRNA调节机制探索较少。本研究中，构建了一个lncRNA-ceRNA网络，以研究aMCI患者血浆中lncRNA和miRNA之间的潜在关系，以及其在AD病理生理过程中发挥的潜在作用。在本研究构建的ceRNA网络中，lncRNA T093863与SNX32彼此竞争影响miR-145表达，在淀粉样蛋白诱导的细胞凋亡中可能发挥特定作用。研究显示，SNX32与AD风险增加有关[10]，SNX32在aMCI血浆中表达上调，其特异性表达可能是AD的最佳生物标志物。MiR-145在癌症中发挥抑癌作用[11]，在AD发病过程中也拥有至关重要的作用，MiR-145可以通过Aβ-p53途径，增强p53的免疫反应性，而p53免疫反应性与AD中淀粉样蛋白诱导的细胞死亡有关[12]。上述失调RNA或可作为早期诊断 AD 的潜在生物标志物及治疗靶点，需进一步扩大样本进行临床实验加以证实。尚不清楚AD中lncRNA T114520和lncRNA T118670的功能，但两者均可通过调节miRNA进而上调含C2域蛋白3的mRNA和蛋白水平。WWC蛋白家族的支架蛋白WW和含C2域蛋白3通过抑制Hippo通路中主要效应物的转录活性在调节细胞增殖，细胞迁移和突触信号传导中起重要作用[13-14]。在AD患者中抗Aβ抗体和γ-/β-分泌酶抑制剂的临床试验失败后[15-17]，找到新的AD治疗策略至关重要。在调节细胞增殖、凋亡和炎症反应中起重要作用的Hippo信号通路与MCI的早期神经元死亡有关。细胞内生成的Aβ通过隔离YAP相关蛋白，损害YAP相关蛋白的功能进而引起了神经元坏死，减少了脑神经元的数量。因此，需进一步探索在Aβ产生之前的某个阶段的遗传调控机制并进行干预，减少Aβ产生。lncRNA T114520和lncRNA T118670可以作为AD早期治疗的潜在靶点，但目前对于lncRNA T114520和lncRNA T118670知之甚少，还需进一步完善相关实验，探索其在AD中的生物学和分析机制。在构建的ceRNA网络中，本研究显示，与淀粉样蛋白诱导的细胞死亡相关的miRNA、lncRNA和mRNA之间的新关系，为进一步研究提供了潜在的治疗靶点和诊断相关的生物标志物。
本研究对ceRNA网络中差异表达mRNA及其共表达基因进行GO富集和KEGG分析，以更好地了解差异表达的RNA在AD发病机制中的生物学功能和潜在机制。GO分析显示，其主要参与RNA代谢过程，调节基因表达、细胞质应激、细胞核功能，调节转录因子活性和DNA相关转录因子活性等生物过程，可见在疾病早期异常调节的RNA参与了基因表观遗传调控及转录和转录后加工过程，影响了疾病的病理生理过程。KEGG分析显示其参与了单纯疱疹病毒1感染途径、催产素信号传导途径、甘露糖型O-聚糖生物合成途径、叶酸生物合成途径、EGFR酪氨酸激酶抑制途径等通路。
本研究首次分析了AD无症状阶段的aMCI患者外周血浆中失调的lncRNA、miRNA、mRNA，可作为潜在的AD早期诊断生物学标志物，同时本研究还构建了差异表达RNA的ceRNA网络并进行分析，显示lncRNA T114520-has-miR-622-含C2域蛋白3等调节通路明显失调，可能是AD发生发展的重要因素，通过调节相关通路，或可以为AD发生的分子途径和治疗策略提供新观点。
[1] 郭静，王智超，吴雨潇，等.基于“凡土脏取决于胆”议从胆论治阿尔茨海默病[J].中华中医药学刊，2020,38(1)：93-95.
[2] 殷贺，刘广志.银杏叶提取物治疗阿尔茨海默病的作用机制研究进展[J].中国医药，2020,15(1)：151-154.
[3] 李倩，胡书江，刘晓丽，等.团体怀旧疗法对轻度阿尔茨海默病患者认知能力及生活质量的影响[J].中国实用神经疾病杂志，2020,23(2)：162-165.
[4] Sanford AM.Mild cognitive impairment[J].Clin Geriatr Med，2017，33(3):325-337.
[5] Moreno-García L,López-Royo T,Calvo AC,et al.Competing endogenous RNA networks as biomarkers in neurodegenerative diseases[J].Int J Mol Sci，2020，21(24):9582.
[6] 吴金隆，林张良，杨堃，等.阿尔茨海默病患者血清8-OHdG、MnSOD水平与认知功能的相关性分析[J].重庆医学，2020,49(10)：1639-1642.
[7] Jia L,Zhu M,Kong C,et al.Blood neuro-exosomal synaptic proteins predict Alzheimer′s disease at the asymptomatic stage[J].Alzheimers Dement，2021，17(1):49-60.
[8] Gao XR,Huang H，Kim H.Genome-wide association analyses identify 139 loci associated with macular thickness in the UK Biobank cohort[J].Hum Mol Genet，2019，28(7):1162-1172.
[9] Song YX,Sun JX,Zhao JH,et al.Non-coding RNAs participate in the regulatory network of CLDN4 via ceRNA mediated miRNA evasion[J].Nat Commun，2017，8(1):289.
[10] Kibinge NK,Relton CL,Gaunt TR,et al.Characterizing the causal pathway for genetic variants associated with neurological phenotypes using human brain-derived proteome data[J].Am J Hum Genet，2020，106(6):885-892.
[11] 张雅敏，王建平，张毅，等.载脂蛋白E基因多态性及性别与阿尔茨海默病小鼠免疫功能及认知功能的相关性[J].中国老年学杂志，2019,39(14)：3540-3542.
[12] 王雪松，孔立红，余超超，等.阿尔茨海默病外周血早期生物标志物的研究进展[J].中国全科医学，2020,23(2)：136-140.
[13] 冯枫，周波，姚洪祥，等.阿尔茨海默病及遗忘型轻度认知功能损害的海马亚区与全脑功能连接的研究[J].中华保健医学杂志，2020,22(1)：34-37.
[14] Han Q,Kremerskothen J,Lin X,et al.WWC3 inhibits epithelial-mesenchymal transition of lung cancer by activating Hippo-YAP signaling[J].Onco Targets Ther，2018，11:2581-2591.
[15] 冯枫，周波，王磊，等.阿尔茨海默病及遗忘型轻度认知功能损害中海马丘脑功能连接和结构连接的相关性研究[J].中华内科杂志，2019,58(9)：662-667.
[16] Honig LS,Vellas B,Woodward M,et al.Trial of solanezumab for mild dementia due to alzheimer′s disease[J].N Engl J Med，2018，378(4):321-330.
[17] Mullard A.BACE failures lower AD expectations,again[J].Nat Rev Drug Discov，2018，17(6):385.