摘要： [摘要] 目的 探索受体相互作用蛋白激酶 3 ( receptor-interactingproteinkinase3 , RIPK3 )的下游信号通路。
方法 向实验组 SH-SY5Y 细胞内转染 pCMV6-RIPK3 质粒上调细胞内 RIPK3 的表达水平,对照组细胞转染相应
的空载 质 粒。通 过 Westernblot 检 测 细 胞 内 RIPK3 的 表 达 水 平。 3- ( 4 , 5- 二 甲 基 噻 唑)[ 3- ( 4 , 5-dimethyl-2-
thiazolyl ), MTT ]实验获得 2 组细胞增殖曲线确定外源性 RIPK3 在细胞内具有的生物学活性。通过 RNAseq 检测
2 组细胞基因转录差异,并在生物通路分析( ingenuitypathwayanalysis , IPA )数据库中进行数据分析,获得 RIPK3
的下游信号通路及其中的关键分子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白( mammaliantargetofrapamycin , mTOR )。采用微滴
式数字化 PCR ( dropletdigitalPCR , ddPCR )对 mTOR 转录水平的差异进行验证。结果 质粒 DNA 整合到细胞基
因组内, Westernblot 提示外源性 RIPK3 在实验组细胞内稳定表达,
MTT 结果证明其在细胞内能够抑制细胞增
殖。 RNAseq 及 IPA 分析结果提示过表达 RIPK3 能够导致
mTOR 转录水平发生上调,并对其下游的基因,包括固
醇反应结合蛋白( sterol-responsebindingproteins ,
SREBPs )、 p70 核糖体 S6 蛋白激酶( p70ribosomalS6protein
kinases , S6K )、真核生物起始因子 4E 结合蛋白( eukaryoticinitiationfactor4E-bindingproteins , 4E-BPs )和 ULK
( unc-51-likekinase )激酶复合体的转录具有明显的调节作用。 ddPCR 实验结果中 mTOR 表达改变趋势与 RNAseq
基本一致。结论 RIPK3 能够调控 mTOR 及其下游信号通路中 SREBPs 、 S6K 、 4E-BPs 和 ULK 基因转录水平,进
而在神经系统生长发育和疾病进展中发挥重要作用。
